ICS 65.020.30 SN B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4914—2017 鲑鱼甲病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for infection with salmonid alphavirus 以正式出版 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 以正式出版文本为准 SN/T4914—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参考了世界动物卫生组织（OE）《水生动物疾病诊断手册》2016版中第2.3.6章“INFECTION WITH SALMONID ALPHAVIRUS" 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：刘、于力、郑晓聪、王津津、贾鹏、何俊强、史秀杰、兰文升、杨锦舜。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T49142017 鲑鱼甲病毒病检疫技术规范 1范围 本标准规定了鲑鱼甲病毒组织病理、病毒分离、逆转录聚合酶链反应、实时荧光逆转录聚合酶 链反应、间接免疫荧光的检测方法。 本标准适用于鲑鱼甲病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 3缩略语 下列缩略语延用于本文件。 lmonembryo-214) CPE：细胞病变（Cytopathiceffect） Ct：达到阈值的循环数（Cyclethreshold） dATP：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（Deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸（Deoxycytidinetriphosphate） DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethypyrocarbonate） dGTP：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸（Deoxyguanosinetriphosphate） dNTPs：三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleotidetriphosphates） dTTP：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（Deoxythymidinetriphosphate） EB：溴化乙锭（Ethidiumbromide） EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid） FITC：异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate） HEPES：4-羟乙基呱嗪乙硫磺酸（4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonicacid） IFAT：间接免疫荧光（Indirectfluorescentantibodytest） IPNV：传染性胰腺坏死病毒（Infectiouspancreaticnecrosisvirus） RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid） RNase：酶（Ribonuclease，RNA） RT-PCR：逆转录聚合酶链反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction） SAV：鲑鱼甲病毒（Salmonidalphavirus） 4疾病概述 鲑鱼甲病毒病主要感染鲑科鱼类，该病病原鲑鱼甲病毒（SAV），属于披膜病毒科（Togaviridae） 1 SN/T4914—2017 甲病毒属（Alphavirus），其基因组为线性单股正链RNA。参见附录A。 5试剂和材料 5.1 水：符合GB/T6682中一级水的规格，用DEPC处理以除掉RNA酶。 5.2SAV病毒参考株，抗SAV抗体，由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。 5.310%甲醛。 5.4乙醇：70%、80%、95%及无水乙醇。 5.5二甲苯。 5.6石蜡。 5.7苏木精染液。 5.80.5%伊红乙醇溶液。 5.9中性树脂。 5.10 孵育液（见附录B中B.1）。 5.11 细胞培养液（见附录B中B.2)。 5.12 CHSE-214细胞系：用细胞培养液20℃培养。 为准 5.13 逆转录酶：20U/μuL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 5.14 RNase抑制剂：20U/uL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化 Trizol试剂：RNA抽提试剂，4℃保存。 5.15 5.16 Taq酶：5U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 5.17 dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmoL/L。 5.18RT-PCR引物的序列如下： E2F: 5'-CCG-TTG-CGG-CCA-CAC-TGG-ATG-3 E2R: 5'-CCT-CAT-AGG-TGA-TCG-ACG-GCA-G-3' 扩增糖蛋白E2基因516bp的片段（参见附录C）。引物浓度为40umoL/L。 5.19实时荧光RT-PCR的引物和探针的序列如下： QnsP1F: 5'-CCG-GCC-CTG-AAC-CAG-TT-3 QnsP1R: 5'-GTA-GCC-AAG-TGG-GAG-AAA-GCT-3 探针:5'-FAM-CTG-GCC-ACC-ACT-TCG-A-BHQ1-3" 扩增非结构蛋白nsP1基因107bp的片段。引物浓度为40μmoL/L，探针浓度为10μmoL/L。 5.2075%乙醇：用无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷到-20℃。 5.21 三氯甲烷：4℃保存。 5.22 异丙醇：4℃保存。 5.23 3DNA相对分子质量标准：分子量大小100bp~2000bp间的DNA片段，-20℃保存。 6 器材和设备 6.1包埋机。 6.2切片机。 6.396孔细胞培养板。 6.4倒置显微镜。 6.5荧光显微镜。 6.6恒温培养箱。 普通冰箱和超低温冰箱。 2 SN/T4914—2017 6.8组织研磨器（处理方法参见附录D）。 6.9离心机和离心管（处理方法参见附录D）。 6.10PCR扩增仪。 6.11荧光PCR扩增仪。 6.12水平电泳仪。 6.13微量移液器及吸头（处理方法参见附录D)。 6.14 凝胶成像仪。 6.15制冰机。 7临床症状 一般表现为食欲减退，体型瘦长，昏睡，眼突，腹水以及出现粪便拖尾，无法保持在水中的位 置，螺旋或绕圈地游动，或者在水底不动。病鱼心脏苍白，肠道空虚、有黄色黏液，体内脂肪很少， 有时在幽门、盲肠和四周的脂肪出现斑出血。 8组织病理 8.1操作步骤 本为准 取鱼的胰腺、心肌、骨骼肌，用10%甲醛（5.3）固定至少24h。固定好的组织按照常规石蜡切 片方法制作切片，用苏木精－伊红（H&E）染色后封片，显微镜下观察。 8.2结果判定 8.2.1典型组织病理病变为胰腺外分泌组织丧失，心肌、骨骼肌坏死和炎症。 8.2.2检测样品中观察到典型病变，判定为阳性 8.2.3 3检测样品中没有观察到典型病变，判定为阴性。 9病毒分离 9.1样品采集 取样数量按GB/T18088的规定执行，优先选取具有临床症状的个体，宜每5尾鱼一个小样。若 有症状的鱼每1尾作为一个小样，体长<4cm的鱼苗取整条鱼，但如有卵黄囊需除去；体长4cm~ 6cm的鱼苗取所有内脏和鳃；体长<6cm的鱼取鳃、心、肾。 用于组织病理检查的，取胰、心肌、骨骼肌。 9.2样品处理 对组织称重后，用组织研磨器制备组织匀浆，用孵育液（5.10）制备2%的组织悬液。于15℃ 孵育4h，或4℃孵育过夜。4000g离心15min，收集上清液。 9.3病毒分离 用孵育液（5.10）对2%组织匀浆上清液作两次10倍稀释，将3个稀释度的上清液分别接种到 生长24h以内的CHSE-214细胞单层中，每孔（2cm）最多接种100μL。15℃吸附2h~3h后，吸 去稀释液，加人细胞培养液（5.11），置于15℃培养。同时设置阳性对照和阴性对照。 当样品来自IPNV的流行区，在接毒之前需将稀释液与适当浓度抗IPNV血清（中和效价不低于 3