SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4877.6-2017 基因条形码筛查方法 第6部分：检疫性嗜酸菌 DNA barcoding screening method-Part 6 :Quarantine Acidovorax spp 2017-08-29发布 2018-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4877.62017 前 創言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； 第3部分：检疫性植原体； 第4部分：检疫性茎点霉； 一第5部分：检疫性拟茎点霉； 第6部分：检疫性嗜酸菌； —第7部分：检疫性轮枝菌； 第8部分：检疫性炭疽菌； 一第9部分：检疫性腥黑粉菌； 第10部分：检疫性疫霉。 本部分为SN/T4877的第6部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草， 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 检疫科学研究院。 本部分主要起草人：冯建军、赵文军、田茜、汪莹、龙海、程颖慧、郑耘、章桂明、陈枝楠。 SN/T4877.6—2017 基因条形码筛查方法 第6部分：检疫性嗜酸菌 1范围 SN/T4877的本部分规定了Acidovorarcitrulli、Acidovorarcattleyae和Acidovorarkonjaci三 种检疫性嗜酸菌的DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。 本部分适用于Acidovorarcitrulli、Acidovorarcattleyae和Acidovorarkonjaci三种检疫性嗜酸 菌的筛查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1465 西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法 SN/T3681 魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码DNAbarcode 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 内部转录间隔区internaltranscribedspacer；ITS 在rDNA基因中，位于保守16S和23SrDNA间隔区之间的序列，包括部分tRNA基因和一些非 编码区，由于进化选择压力较小，ITS序列比16S和23SrDNA序列本身的变异性更大，因此，ITS适合 用于细菌种下不同群体的特异性检测与鉴定。 4嗜酸菌的基本信息 学名：Acidovorar 分类地位：细菌界（bacteria），薄壁菌门（Gracilicutes）假单胞菌科（Pseudomonaceae）嗜酸菌属 （Acidouorar），属rRNA组I。目前植物性嗜酸菌有5个种，其中前3个为进境植物检疫性有害生物。 瓜类细菌性果斑病菌Acidovorarcitrulli（Schaadetal.1978)Schaadetal.2008 兰花褐斑病菌Acidovoracattleyae（Pavarino1911)Schaadetal.2008 魔芋细菌性叶斑病菌Acidovorarkonjaci（Willemsetal.1992） 燕麦嗜酸菌Acidouoraravenae（Manns1909)Willemsetal.1992,Schaadetal.2008 水稻褐条病菌Acidovoraroryzae(Schaadetal.2008) 1 SN/T 4877.62017 5方法原理 根据嗜酸菌属16S-23SrDNA的ITS序列分析对检疫性嗜酸菌进行DNA条形码筛查。 6 仪器、用具及试剂 6.1仪器 PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、微量分光光度仪、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰 箱、旋涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统 6.2用具 可调移液器（最大量程为20μL、200L、1000μL)及相关吸头、离心管（2mL）、PCR管、量筒、烧 杯、酒精灯、镊子等。 6.3培养基和试剂 营养肉陈液体培养基（NB）配方为3g牛肉浸膏（Beef-extract)，5-g蛋白陈（Peptone），1000mL蒸 后倒入培养皿中即可配制成NA培养基。 所有试剂见附录A、附录B。 7筛查方法 7.1DNA制备 对拟筛查的分离物进行液体培养或平板培养，利用CTAB法或商品化细菌DNA提取试剂盒提取 制备DNA，测定DNA浓度及纯度测定后，保存于-20℃冰箱备用。具体步骤见附录A。 7.2ITS扩增及测序 利用引物进行ITS序列扩增，然后将扩增PCR产物测序.具体步骤见附录B。 7.3序列分析 将测序结果进行整理拼接，去除两端测序引物部分序列，然后将序列在美国国家生物技术信息中心 (NCBI)数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，三种检疫性嗜酸菌的DNA 条形码见附录C。 8结果判定 若PCR扩增产物电泳结果为阳性，且产物大小约550bp时，可以初步判定该分离物为嗜酸菌；若 PCR扩增产物电泳结果为阴性，可以初步判定该分离物不属于嗜酸菌。 若将该产物序列在NCBI数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，与 数据库中某种检疫性瞻酸菌ITS基因序列同源性≥99%，则初步判定该菌为对应检疫性嗜酸菌。 若进一步判定为目标检疫性嗜龄菌，需要根据标准方法（SN/T1465或SN/T3681)进行最终鉴 2 SN/T4877.6—2017 定，无相应标准的按照常规细菌鉴定方法进行最终鉴定。 样品保存与复核 9 9.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出检疫性嗜酸菌的样品应保存于一20℃冰箱中，以备 复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。 9.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为检疫性嗜酸菌的菌株，将菌体挑到30%的甘油中混匀，一80℃下保存。 9.3 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳图， SN/T 4877.6—2017 附录A （规范性附录） DNA提取 A.1试剂 十二烷基肌氨酸钠（N-Lauroylsarcosinesodiumsalt，NLS）、十六烷基三甲基漠化铵（CTAB）、十二 烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、磷酸氢 化钠（NaCI)、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等。 A.2溶液 A.2.1 DNA抽提液 CTAB 20 g/L Tris-HCl 100 mmol/L(pH 8.0) EDTA 20 mmol/L(pH 8.0) NaCI 1.4 mol/L A.2.2 10%NLS液 10 g 十二烷基肌氨酸钠 无菌水 1 mL A.2.3 TE缓冲液 Tris 10 mmol/L. EDTA 1 mmol/L(pH 8.0) A.2.4 CTAB/NaCI溶液 10%CTAB 0.7 mol/L NaCl A.2.5 蛋白酶K 蛋白酶K 20 mg 无菌水 1 ml. 37℃水浴1h后分装成单次使用的小份，于一20℃备用 A.3DNA提取 挑取少量纯培养菌株的菌落到1.5ml.离心管中，加人1ml.无菌水混匀后.10000r/min离心 10min；弃上清，加人500μl.DNA抽提液、20μl.蛋白酶K、80μl.10%NIS混合后，55℃水浴1h～ 4 SN/T 4877.6—2017 8000r/min离心15min；弃上清，加人600μLTE缓冲液、30μL10%SDS、12μL蛋白酶K，37℃温育 氯仿-异戊醇，8000r/min离心5min，取上清，再加等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提，8000r/min离心 5min；取上清，加2倍体积无水乙醇于一20℃沉淀核酸，4℃6000r/min离心10min；弃上清，加 500μL70%乙醇洗涤，4℃6000r/min离心10min，弃上清，真空干燥DNA，加适量TE悬浮，一20℃ 短期贮存或一80℃长期贮存备用。 基因组DNA提取也可采用等效商品DNA提取试剂盒。 5