SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4877.4—2017 基因条形码筛查方法 第4部分：检疫性茎点霉 DNA barcoding screening method-Part 4:Quarantine Phoma spp. 2017-08-29发布 2018-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4877.4—2017 ■ 前 言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； 第3部分：检疫性植原体； 第4部分：检疫性茎点霉； 第5部分：检疫性拟茎点霉； 第6部分：检疫性嗜酸菌； 第7部分：检疫性轮枝菌； 第8部分：检疫性炭疽菌； 第9部分：检疫性腥黑粉菌； 第10部分：检疫性疫霉。 本部分为SN/T4877的第4部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中国科学院微生物研究所、中华人民共 和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本部分起草人：段维军、蔡磊、陈倩、廖芳、郭立新、张慧丽、陈先锋、朱水芳。 SN/T 4877.42017 基因条形码筛查方法 第4部分：检疫性茎点霉 1范围 SN/T4877的本部分规定了检疫性茎点霉DNA条形码筛查方法。 本部分适用于进境植物及其产品中检疫性茎点霉的筛查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1135.8马铃薯环疽病菌检疫鉴定方法 SN/T2589植物病原真菌检测规范 SN/T3288柠檬干枯病菌检疫鉴定方法 SN/T3682 葡萄茎枯病菌检疫鉴定方法 SN/T3755 豌豆脚腐病菌检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 DNAbarcode 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 内部间隔转录区序列internaltranscribedspacer;ITS 在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从5'～3'依 次为：外部转录间隔区、18S基因、内部转录间隔区1(ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2(ITS2）、28S 基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区域， ITS1和ITS2作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在 种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详 尽的系统学分析所需的可遗传性状。 3.3 β-微管蛋白基因beta-tubulin，TUB β-微管蛋白基因既有保守的外显子又有许多内含子，已被用于真菌各级分类水平上的系统发育研 究。并且发现其无论在低分类阶元的系统发育研究中，还是复合种的研究中，甚至对于种内不同地域菌 株间的亲缘关系研究有重要意义。β-微管蛋白基因已在茎点霉属部分物种的研究中显示出较好的区分 程度。 1 SN/T4877.4—2017 3.4 检疫性茎点霉QuarantinePhomaspp. 农业部和国家质检总局于2007年5月29日发布的第862号公告《中华人民共和国进境植物检疫 性有害生物名录》中将植物病原真菌茎点霉属（Phoma）中的马铃薯环疽病菌Phomaerigua Desmazieresf.sp.foveata（Foister）Boerema、葡萄茎枯病菌Phomaglomerata（Corda）Wollenweberet Hochapfel、豌豆脚腐病菌Phomapinodella（L.K.Jones）Morgan-JonesetK.B.Burch和柠檬干枯病菌 Phomatracheiphila（Petri）L.A.Kantsch，etGikaschvili列为我国禁止进境检疫性有害生物。 马铃薯环疽病菌、葡萄茎枯病菌、豌豆脚腐病菌和柠檬干枯病菌详细分类信息见SN/T1135.8、 SN/T3682、SN/T3755、SN/T3288。 4方法原理 根据茎点霉属真菌的核糖体转录间隔区（ITS)和β微管蛋白片段（TUB)的序列特征，应用DNA条 形码技术对检疫性茎点霉进行种类筛查，确定目标真菌是否为检疫性茎点霉及其种属归类。 5仪器用具和试剂 5.1仪器设备与用具 显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微量分光光度仪、电 规PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、DNA提取仪。 5.2主要试剂 化钠（NaOH）、Tris碱、浓盐酸（HCI)、溴化十六烷基三甲铵（CTAB）、氯化钠（NaCI)、聚乙烯吡略烷酮 （PVP）、冰醋酸（CH，COOH）、蒸馏水、氯仿（CHCI:）、异戊醇、70%乙醇 PCR和电泳检测所需试剂：10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ErTaq聚合酶、引物 （表1）、超纯水、DNA片段标记物、琼脂糖、核酸凝胶染料。 6 筛查鉴定方法 6.1样品的采集与处理 样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589进行。 6.2核酸的制备 6.3DNA纯度与浓度的测定 用微量紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度.分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核 酸的纯度和浓度，计算公式如下： DNA纯度=OD/OD DNA浓度=50XODμg/ml 2 SN/T 4877.4—2017 PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.7~1.9 6.4序列扩增测序 利用通用引物对ITS和TUB基因进行扩增测序（具体步骤参见附录B），将序列在Genbank数据 库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与数据库中茎点霉属ITS和TUB基因序 列相似性均大于98%，则进行6.5操作。 6.5序列分析 4种检疫性茎点霉属的ITS和TUB基因参考序列参见附录C。将ITS和TUB基因序列在中国检 疫性有害生物DNA条形码数据库比对分析，采用邻接法构建基于ITS和TUB基因序列的NJ树。 7结果判定 ITS基因序列长度大于50ObP，在美国国家生物技术信息中心（NCBI)数据库或中国检疫性有害生 物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中茎点霉属ITS基因序列同源性大于98%，则判定 该菌为茎点霉属。 TUB基因序列长度大于300bp，在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若 与数据库中茎点霉属某种ITS基因序列同源性大于98%，且在系统进化树中聚在同一分支，则初步判 定为该茎点霉属该种。 若判定为目标检疫性茎点霉，利用相应标准的需要根据标准方法进行最终鉴定，无相应标准的按照 常规真菌鉴定方法进行最终鉴定。 8样品保存 8.1样品保存 分离并最终鉴定为检疫性目标真菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃ 低温冰箱中保存，定期（30d～60d)转接，必要时冻干后长期保存。 8.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。