SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4877.2--2017 基因条形码筛查方法 第2部分：检疫性黄单胞菌 DNA barcoding screening method- Part 2:Quarantine Xanthomonas spp. 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4877.22017 前 言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； 第3部分：检疫性植原体。 本部分为SN/T4877的第2部分。 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共 和国云浮出入境检验检疫局、中华人民共和国满洲里出入境检验检疫局、中国农科院生物技术研究所。 本部分主要起草人：田茜、冯建军、何旭诺、刘玮琦、赵文军、李为民。 1 SN/T4877.22017 基因条形码筛查方法 第2部分：检疫性黄单胞菌 1范围 SN/T4877的本部分规定了检疫性黄单胞菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。 本部分适用于检疫性黄单胞菌的筛查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1400 甘蔗流胶病菌检疫鉴定方法 SN/T2372 水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测方法 SN/T 3278 风信子黄腐病菌检疫鉴定方法 SN/T3431 香蕉坏死条纹病菌检疫鉴定方法 SN/T 4073 芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1DNA条形码 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 216SrRNA基因 原核生物核糖体30S小亚基的组成部分，16SrRNA基因序列具有高度的保守性和特异性，是细菌 种间鉴定的重要依据。 3.3 cpn60基因 编码伴侣蛋白60（cpn60，又叫热休克蛋白60/Hsp60)的基因，为单拷贝基因，广泛存在于细菌及真 核生物细胞中，是系统进化分析的有效分子标记 4 黄单胞菌属基本信息 学名：Xanthomonas 分类地位：细菌界（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），-变形菌纲（Gammaproteobacteria），黄单 胞菌目（Xanthomonodales），黄单胞菌科（Xanthomonodaceae），黄单胞菌属（Xanthomonas）。 黄单胞菌属是最重要的植物病原细菌属，该属目前包括了14个进境植物检疫性有害生物： 1.甘蔗白色条纹病菌（Xanthomonasalbilineans）； 1 SN/T4877.2—2017 2.香蕉坏死条纹病菌（Xanthomonasarboricolapv.celebensis）； 3.胡椒叶斑病菌（Xanthomonasaronopodispv.betlicola）； 4.柑橘溃疡病菌（Xanthomonasazonopodispv.citri）； 5.木薯细菌性萎蒿病菌（Xanthomonasaronopodispv.manihotis）； 6.甘蔗流胶病菌（Xanthomonasaronopodispv.vasculorum）； 7.芒果黑斑病菌（Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae）； 8.香蕉细菌性菱蒿病菌（Xanthomonascampestrispv.musacearum）； 9.木薯细菌性叶斑病菌（Xanthomonascassavae）； 10：草莓角斑病菌（Xanthomonasfragariae）； 1l.风信子黄腐病菌（Xanthomonashyacinthi）； 12.水稻白叶枯病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzae）； 13.水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola）； 14.杨树细菌性溃疡病菌（Xanthomonaspopuli）。 5方法原理 根据细菌核糖体16SrRNA基因序列分析确定目标细菌是否为黄单胞菌，然后根据cpn60基因序 列分析对目标细菌进行筛查。 6仪器设备和主要试剂 6.1 仪器设备 生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、微量分光光度仪、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系 统、冰箱等。 6.2主要试剂 细菌DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水、DNAmarker。 7筛查鉴定方法 7.1DNA制备 对细菌进行液体培养或平板培养，利用商品化细菌DNA提取试剂盒制备细菌总DNA，测定DNA 浓度及纯度后，保存于一20℃冰箱备用。 7.216SrRNA基因序列扩增测序 利用通用引物进行16SrRNA基因扩增测序（具体步骤见附录A)，将序列在Genbank数据库或中 国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与数据库中黄单胞菌16SrRNA基因序列相似 性大于97%，则进行7.3操作。 7.3cpn60基因序列扩增 利用通用引物进行cpn60基因序列扩增测序（具体步骤见附录B)。 2 SN/T 4877.2-—2017 7.4序列分析 将cpn60基因序列在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中比对分析，采用邻接法构建基于 cpn60基因序列的NJ树。 8 结果判定 16SrRNA基因序列长度大于1200bp，在Genebank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码 数据库中进行比对分析，若与数据库中黄单胞菌16SrRNA基因序列相似性大于97%，则判定该菌为 黄单胞菌。 cpn60基因序列长度大于540bp，在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若 与数据库中某黄单胞菌的cpn60基因序列同源性大于98%，且在NJ树中聚在同-分支，则初步判定为 该黄单胞菌。 若判定为目标检疫性黄单胞菌，有相应标准的需要根据标准方法（SN/T3431或SN/T1400或 SN/T4073或SN/T3278或SN/T2372)进行最终鉴定，无相应标准的需要按照常规细菌鉴定方法进 行最终鉴定。 9样品保存 9.1 祥品保存 分离并最终鉴定为检疫性目标细菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃ 低温冰箱中保存，定期（30天～60天）转接，必要时冻干后长期保存。 9.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。 SN/T 4877.22017 附录A (规范性附录） 16SrRNA基因扩增程序 A.1 引物序列 16sF-LYP-3:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' 16sR-LYP-3:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGACGGGCGGTGTGTRCA-3" 注：下划线部分为测序引物，全部序列都要合成（R=G或A)。 A.2PCR体系及扩增程序 推荐用50μL体系，采用商品化的PCRPremix进行PCR扩增，反应体系中引物浓度为200nmol/L， DNA模板量为10ng~100ng。 PCR反应程序94℃5min;94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。 该引物为通用引物，每次做PCR应做空白对照，以确认是否污染。 A.3 电泳及测序 取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物大小：约1200bp左右。测序引物为M13-47及 RV-M(或M13-48)。 SN/T 4877.2—2017 附录 （规范性附录） cpn60基因扩增程序 B.1 引物序列 先用H1594/H1595扩增，若效果不理想，再利用H729/H730扩增。 H1594/H1595 H1594:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGACGTCGCCGGTGACGGCACCACCAC-3 H729/H730 H729:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC-3 H730:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAYKIYKITCICCRAAICCIGGIGC 注：下划线部分为测序引物，全部序列都要合成（I=次黄嘌岭，Y=C或T，R=G或A，K=G或T)。 B.2 PCR体系及扩增程序 推荐用50μL体系，采用商品化的PCRPremix进行PCR扩增，反应体系中引物浓度为200nmol/L， DNA模板量为10ng~100ng。 PCR反应程序： H1594/H1595:94℃5min;94℃30s，57℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。 H729/H730:94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。 该引物为通用引物，每次做PCR应做空白对照，以确认是否污染。 B.3 电泳与测序 取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物大小：555bp，由于添加了测序引物，在电泳