SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4877.11—2017 基因条形码筛查方法 第11部分：检疫性异株苋亚属 DNA barcoding screening methodPart 11:Quarantine Subgen.Acnida L 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4877.11—2017 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为11个部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； 第3部分：检疫性植原体； 第4部分：检疫性茎点霉； 第5部分：检疫性拟茎点霉； 第6部分：检疫性嗜酸菌； 第7部分：检疫性轮枝菌； 第8部分：检疫性炭疽菌； 第9部分：检疫性腥黑粉菌； 第10部分：检疫性疫霉； 第11部分：检疫性异株苋亚属。 本部分为SN/T4877的第11部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国环境科学研究院、中华人民共和国上海出人境检 验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。 本部分起草人：宋云、徐晗、刘勇波、印丽萍、傅怡宁、徐瑛。 I SN/T 4877.11—2017 基因条形码筛查方法 第11部分：检疫性异株苋亚属 1范围 SN/T4877的本部分规定了检疫性异株苋亚属杂草DNA条形码筛查方法中DNA提取、基因序列 的扩增、分析及结果判定等。 本部分适用于检疫性异株苋亚属的长芒苋、糙果苋、西部苋的筛查 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T3710异株苋亚属检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码DNAbarcode 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 ITS 基因ITS gene;internal transcribed spacer gene 真核生物核糖体DNA上的内转录间隔区，位于18S和26SrDNA基因之间的一段序列，具有高度 的保守性和特异性，广泛应用于被子植物属、种水平的分类与鉴定。 3.3 单核苷酸多态性SNPsinglenucleotide-polymorphism 在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。这种变异可由单个碱基的转换 或颠换所引起，也可由碱基的插人或缺失所致。 3.4 NJ树NJ tree 基于某个基因序列进行系统进化分析，根据NJ(Neighbor-Joining)算法，通过碱基的变化和差异构 建的进化树。 异株苋亚属的基本信息 4 学名：Subgen.Acnida L. 分类地位：植物界（Plantae），被子植物门（Angiospermae），双子叶植物纲（Actinobacteria），石竹目 （Actinomycetales），苋科（Amaranthaceae），苋属（Amaranthus） 1 SN/T4877.112017 苋属分为觉亚属、白苋亚属和异株苋亚属，共有70余种。异株苋亚属中有3种列为进境植物检疫 性有害生物： 长芒苋AmaranthuspalmeriS.Watson 糙果Amaranthustuberculatus(Moq.)Sauer 西部AmaranthusrudisJ.D.Sauer 5 方法原理 根据ITS序列确定目标杂草是否为长芒苋，然后根据SNP标记设计特异性引物分析确定目标杂草 为糙果苋和西部苋。 6仪器设备和主要试剂 6.11 仪器设备 生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、核酸蛋白检测仪、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系 统等。 6.2 主要试剂 植物组织DNA提取试剂盒、限制性内切酶、PCRPremix、超纯水、DNAmarker。 7筛查鉴定方法 7.1DNA制备 用植物组织（叶片、种子等）提取DNA，采用商品化植物DNA提取试剂盒制备植物总DNA，测定 DNA浓度及纯度后，保存至一20℃冰箱备用。本部分所用实验材料均按照SN/T3710复核鉴定。 7.2ITS序列扩增测序 利用通用引物进行ITS序列扩增（见附录A）。将序列在Genbank数据库或中国检疫性有害生物 DNA条形码数据库中进行比对，若与数据库中异株觉亚属ITS序列相似性大于97%，则进行7.3 操作。 7.3 3序列分析 3种检疫性异株觉亚属的ITS基因参考序列参见附录B。将ITS基因序列在中国检疫性有害生物 DNA条形码数据库比对分析，采用邻接法构建基于ITS基因序列的NJ树。若与数据库中异株苋亚属 长芒ITS序列同源性大于97%，且在NJ树中聚在同分支，则进行8.1操作；若与数据库中异株苋 亚属糙果和西部苋ITS序列同源性大于97%，且在NJ树中聚在同-分支，则进行7.4操作。 7.4特异性引物序列扩增 根据SNP标记设计特异性引物并进行序列扩增（见附录A）。扩增产物进行限制性内切酶（StyI） 反应，并对反应产物进行凝胶电泳分析（见附录A）。 2 SN/T 4877.11—2017 8结果判定 8.1长芒苋 ITS序列长度620bp～640bp，在GenBank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中 进行比对，若与数据库中异株苋亚属长芒苋ITS序列同源性大于97%，且在NJ树中聚在同一分支，则 判定该杂草为异株苋亚属长芒苋，并结合形态特征进行最终判定。 8.2西部苋和糙果苋 ITS序列长度620bp～640bp，在GenBank数据库或检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行 比对，若与数据库中异株苋亚属西部苋和糙果苋ITS序列同源性大于97%，且在NJ树中聚在同一分 支，则判定该杂草为异株苋亚属西部苋或糙果苋。并继续进一步分析，进行7.4操作。7.4中凝胶电泳 条带显示为约460bp、280bp、180bp3条带，则判定该杂草为异株宽亚属糙果苋。7.4中凝胶电泳条带 显示为约460bp一条带，则判定该杂草为异株苋亚属西部苋。初步判定结果需结合形态特征进行最终 判定。 9 样品保存 9.1# 样品保存 将最终鉴定为检疫性目标物种的杂草植物组织置于含硅胶的密封袋中，注明编号、名称、产地、进出 境日期等，经手人签字后置于一20℃低温冰箱中保存至少12个月。 9.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，测序序列需要保存电子文件。