SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4877.1—2017 基因条形码筛查方法 第1部分：检疫性棒形杆菌 DNA barcoding screening method--Part 1:Quarantine Clavibacter spp. 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 刮涂层查真伪 SN/T 4877.1—2017 前 創言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； - 第2部分：检疫性黄单胞菌； 一第3部分：检疫性植原体。 本部分为SN/T4877的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黄岛出人境检验检疫局、中华人民共 和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验 检疫局。 本部分主要起草人：赵文军、夏明星、张凤娟、田茜、高文娜、冯建军、廖芳。 1 SN/T4877.1—2017 基因条形码筛查方法 第1部分：检疫性棒形杆菌 1范围 SN/T4877的本部分规定了检疫性棒形杆菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。 本部分适用于检疫性棒形杆菌的筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1135.5马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法 SN/T2568 3番茄细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法 SN/T2666 6首猎细菌性萎爲病菌检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 16SrRNA基因 原核生物核糖体30S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中，16SrRNA基因的进化相对保 守，被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺，基因序列具有高度的保守性和特异性。 16SrRNA基因序列是细菌检测鉴定与分类研究中应用最多的基因序列，是细菌种间鉴定的重要 依据。 3.3 gyrB基因 编码DNA解旋酶B亚单位的基因，是单拷贝的看家基因，普遍存在于各种细菌中，本部分中gyrB 基因序列作为细菌条形码基因进行种及种下阶元的筛查鉴定。 4 棒形杆菌的基本信息 学名：Clavibacter 分类地位：细菌界（Bacteria），放线菌门（Actinobacteria），放线菌纲（Actinobacteria），放线菌目 （Actinomycetales），微杆菌科（Microbacteriaceae）。目前棒形杆菌属的植物病原细菌只有一个种- 密执安棒形杆菌（Clauibactermichiganensis），该种包括如下5个亚种，其中前4个为进境植物检疫性 有害生物： 1 SN/T4877.1—2017 首猎细菌性萎為病菌（Claibactermichiganensissubsp.insidiosus）； 番茄溃疡病菌（Clauibactermichiganensissubsp.michiganensis）； 玉米内州菱焉病菌（Clavibactermichiganensissubsp.nebraskensis）； 马铃薯环腐病菌（Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus）； 小麦细菌性花叶病菌（Clavibactermichiganensissubsp.tessellarius）。 5方法原理 根据细菌核糖体16SrRNA基因序列分析确定目标细菌是否为棒形杆菌，然后根据gyrB基因序 列分析确定目标细菌为某个亚种。 6仪器设备和主要试剂 6.11 仪器设备 生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、核酸蛋白分析仪、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系 统、冰箱等。 6.2主要试剂 细菌DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水、DNAmarker等 7筛查鉴定方法 7.1DNA制备 对细菌进行液体培养或平板培养，利用商品化细菌DNA提取试剂盒制备细菌总DNA，测定DNA 浓度及纯度后，保存于一20℃冰箱备用。 7.216SrRNA基因序列扩增测序 利用通用引物进行16SrRNA基因扩增测序（具体步骤见附录A）将序列在Genbank数据库或中 国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与数据库中棒形杆菌16SrRNA基因序列相似 性大于97%，则进行7.3操作。 7.3gyrB基因序列的扩增 利用通用引物进行gyrB基因序列扩增测序（具体步骤见附录B)。 7.4序列分析 4种检疫性棒形杆菌的gyrB基因参考序列参见附录C。将gvrB基因序列在中国检疫性有害生 物DNA条形码数据库比对分析.采川邻接法构建基于gyrB基因序列的NJ树。 8结果判定 据库中进行比对分析，若与数据库中棒形杆菌16SrRNA基因序列同源性大于97%.则判定该菌为棒 2 SN/T 4877.1—2017 形杆菌。 gyrB基因序列长度大于500bp，在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若 与数据库中密执安棒形杆菌某亚种的gyrB基因序列同源性大于98%，且在NJ树中聚在同一分支，则 初步判定为该棒形杆菌为该亚种。 若判定为目标检疫性棒形杆菌，有相应标准的需要根据标准方法（SN/T1135.5或SN/T2666或 9样品保存 9.1 样品保存 分离并最终鉴定为检疫性目标细菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃ 低温冰箱中保存，定期（30天～60天）转接，必要时冻于后长期保存。 9.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，测序序列需要保存电子文件。