SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4876.5—2017 DNA条形码方法 第5部分：曼陀罗属 MethodforDNAbarcode-Part5:Datura L 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4876.5—2017 前言 SN/T4876《DNA条形码方法》共分为5个部分： 第1部分：检疫性乳白蚁； 第2部分：检疫性断眼天牛； 第3部分：检疫性卷蛾； 第4部分：检疫性高粱属； 第5部分：曼陀罗属。 本部分为SN/T4876的第5部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国黄埔出人境检验检疫 局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国 宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国检验检疫科学院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中 华人民共和国福建出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：印丽萍、傅怡宁、左然玲、伏建国、邵秀玲、徐瑛、范晓红、吴海荣、于文涛。 1 SN/T4876.52017 DNA条形码方法 第5部分：曼陀罗属 1范围 SN/T4876的本部分规定了曼陀罗属植物的DNA条形码检测方法。 本部分适用于曼陀罗属植物的DNA条形码的测定、结果比对分析与判定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T4343 曼陀罗属检疫鉴定方法 SN/T4468 粗刺曼陀罗检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 马DNAbarcode 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。研究人员 可用DNA条形码技术鉴定物种及物种间亲缘关系，修改已有的分类学结论等。 3.2 凭证标本voucherspecimen 一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存的标本，它 可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。模式标本也属凭证标本。凭证标本 记录的存档信息应具有追溯性。凭证标本的保存非常重要，需要有详细的标本编号、存放地点等详细信 息，以便于日后查证。 3.3 内转录间隔区 theinternal transcribed spacer;ITS 核糖体RNA（rRNA)基因非转录区的一部分，位于核仁区。用于鉴定的ITS序列通常包括ITS1、 5.8S和ITS2。 4 曼陀罗属植物基本信息 中文名：曼陀罗属 学名：DaturaL. 分类地位（恩格勒系统，1964年）：被子植物门Angiospermae双子叶植物纲Dicotyledoneae合瓣花 亚纲Sympetalae管花目Tubiflorae茄亚目Solanineae茄科Solanaceae 分布情况：据报道，该属在全球分布有9种～13种，此外还有些具有争议性的多年生木本植物种在 很多报道中都被分开归类到新的属，即：木曼陀罗属BrugmansiaPers.；这些植物种自然分布于中南美 1 SN/T4876.5—2017 洲、亚洲和北非。另据，《中国植物志》记载，中国分布有四种，即：毛曼陀罗D.inoriaMiller，洋金花 D.metelL.，曼陀罗D.stramoniumL.和木本曼陀罗D.arboreaL.，并特别指出中国没有粗刺曼陀罗 D.ferorL.的分布；而据FloraofChina记载，中国仅有三种分布，即：毛曼陀罗D.inoriaMiller，洋金 花D.metelL.，曼陀罗D.stramoniumL.，而木本曼陀罗D.arboreaL.归属于新的木曼陀罗属Brug mansia Pers.。 传播途径：随交通运输工具、农具等传播到新的地区，也可通过混杂于谷物、种子和其他产品中远距 离传播。 5方法原理 根据曼陀罗属的ITS序列特征，应用DNA条形码技术对曼陀罗属及部分种进行检测。 6仪器设备和主要试剂 6.1仪器设备 PCR仪、电子天平（1/10000g）、冷冻混合研磨仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、解剖 镜、PH计、涡旋振荡器、冰箱。 6.2用具 可调式微量移液器（2μL、10pL L、200μL、1000μL)及相应的吸头、离心管、PCR管、 EP管、3.0mm灭菌钢珠等。 6.3主要试剂 植物基因组提取试剂盒、超纯水,DNAMarker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷三磷酸 （dNTPs）、Taq聚合酶、10XPCR缓冲液。CTAB法提取试剂（参见附录A的A.1）。 7 筛查鉴定方法 7.1样品的处理 个管内加2粒～3粒直径3.0mm灭菌钢珠，加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨1min(30次/s）。 7.2 2DNA制备 采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的CTAB法提取植物基因组总DNA。改良的 CTAB法方法参见A.2。 7.3DNA条形码基因片段扩增 利用特异性引物进行ITS基因序列扩增，引物序列、反应体系和反应条件见附录B。 7.4 PCR产物的检测 引物可得到约600bp左右的扩增片段。 2 SN/T4876.5—2017 7.5 测序与序列处理 7.5.1测序 取剩余的PCR扩增产物45μL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用DNA产物纯化试剂 盒纯化并测序。测序引物与PCR扩增引物相同。 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列。 7.5.2比对 扩增的PCR产物在600bp左右大小，经处理后得到561bp～563bp大小的片段。登录NCBI数 据库BL.AST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对获得的ITS序列进行比对。 8结果判定 8.1 曼陀罗属的结果判定 若与数据库中序列进行比对，其序列相似性大于等于96%，则判定是曼陀罗属； 若与数据库中序列进行比对，其序列相似性大于等于92%但小于96%的，可使用SN/T4343进行 进一步判定； 若与数据库中序列进行比对，其序列相似性小于92%.则判定不是曼陀罗属。 曼陀罗属的ITS序列（部分ITSI、5.8S和部分ITS2序列）参见附录C的表C.1。 8.2 2粗刺曼陀罗D.ferox的结果判定 见SN/T4468。 8.3 异色曼陀罗D.discolor的结果判定 若与数据库中序列进行比对，其序列相似性为100%，则判定是异色曼陀罗；否则，则判定不是异色 曼陀罗。 8.4 光曼陀罗D.leichhardtii的结果判定 若与数据库中序列进行比对，其序列相似性为100%，则判定是光曼陀罗；否则，则判定不是光曼 陀罗。 9标本与原始数据保存 9.1标本保存 将最终鉴定为检疫性目标物种的植物组织或DNA置于一20℃低温保存。并注明来源，寄主，采集 时间、地点及采集者，保存期为1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则须保存到纠纷解决完毕。 9.2 原始数据保存 样品检测结束后，其原始记录单（应包括DNA序列及测序峰图等内容）和检验报告须归档，妥善保 管，以备复验、谈判和仲裁。 SN/T 4876.52017 附录A （资料性附录） DNA提取方法（改良CTAB法） A.1试剂 CTAB提取液:CTAB20g/L,NaCI1.4mol/L,Tris0.1mol/L(pH8.0),EDTA0.02mol/L （pH8.0），高压灭菌备用。 三氯甲烷：异戊醇：体积分数24：1。 50XTAE缓冲液：242gTris，57.1mL冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），充分溶解混匀 后，加水定容至1L，高压灭菌备用。 10×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖， 1XTE缓冲液：1mL的1mol/LTris-HCl(pH8.0)和0.2mL的EDTA(0.5mol/L)以超纯水定容 到100mL。1mol/LTris-HCl(pH8.0)50ml.的配制：称取Tris碱6.06g，加超纯水40mL溶解，滴加 浓HCl约2.1mL调pH至8.0，定容至50mL；0.5mol/LEDTA（pH8.0)50mL的配制：称取EDTA Na2·2H,09.306g，加双蒸水35ml，剧烈搅拌，用约1gNaOH颗粒调pH至8.0，定容至50mL。 A.2 提取步骤 在含植物粉末的2mL离心管加人已预热至65℃的600μLCTAB提取液，充分振荡混匀；65℃水 浴30min，不时颠倒混匀；10000r/min离心5min，取上清，等体积氯仿（三氯甲烷：异戊醇=24：1） 70%乙醇洗涤1次2次，晾干后，加人20μlTE缓冲液溶解沉淀，保存于一20℃冰箱冷冻备用 4 SN/T4876.5—2017 附 （规范性附录） ITS序列扩增流程 B.1 引物序列 表 B.1 引物序列 目标基因 引物方向 引物序列（5'-3") 扩增片段 正向引物 AAGTCGTAACAAGGTTTC ITS 598 bp 反向引物 AGGGTCTAGGAGCACAAAC B.2 PCR反应体系及参数 表 B.2 PCR反应体系及参数 50μL反应体系加样 成分 储备液浓度 体积/μL dNTP混合物(各10mmol/mL) 2.