SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4876.42017 DNA条形码方法 第4部分：检疫性高梁属 Method for DNA barcode-Part 4 :Quarantine Sorghum L. 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 层查真价 SN/T4876.4—2017 前言 SN/T4876《DNA条形码方法》共分为5个部分： -第1部分：检疫性乳白蚁； 第2部分：检疫性断眼天牛； -第3部分：检疫性卷蛾； 一第4部分：检疫性高粱属； -第5部分：曼陀罗属。 本部分为SN/T4876的第4部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验 检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共 和国福建出人境检验检疫局 本部分主要起草人：印丽萍、薛华杰、张宁、傅怡宁、徐晗、徐瑛、伏建国、魏晓棠、陈冬美、吴海荣、 于文涛。 SN/T4876.4---2017 DNA条形码方法 第4部分：检疫性高梁属 1范围 SN/T4876的本部分规定了检疫性高粱属的DNA条形码检测方法。 本部分适用于使用DNA条形码对检疫性高属进行的测定、结果比对分析与判定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1362假高粱检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码DNAbarcode 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。研究人员 可用DNA条形码技术鉴定物种及物种间亲缘关系，修改已有的分类学结论等。 3.2 凭证标本 voucherspecimen 一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存的标本，它 可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。模式标本也属凭证标本。凭证标本 记录的存档信息应具有追溯性。凭证标本的保存非常重要，需要有详细的标本编号、存放地点等详细信 息，以便于日后查证。 3.3 检疫性高梁属quarantineSorghumL. 《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中列人的：假高粱Sorghumhalepense（L.)Pers.、 黑高粱S.alnumParodi.。 3.4 内转录间隔区 theinternal transcribed spacer;ITs 核糖体RNA(rRNA)基因非转录区的一部分，位于核仁区。用于鉴定的ITS序列通常包括ITS1、 5.8S和ITS2。 3.5 trnT-trnL trnT-trnL间区，位于叶绿体trnT基因和trnL基因的间隔区。该间区进化速率较快，常用于植物 属间、种间的系统发育研究。 1 SN/T4876.4—2017 4高粱属植物基本信息 中文名：高粱属 学名：SorghumMoench 分类地位（恩格勒系统，1964）：单子叶植物纲Monocotyledoneae禾本目Graminales禾本科Gra" mineae黍亚科Panicoideae高粱族Trib.Andropogoneae高粱亚族Subtrib.Sorghinae。 基本情况：高粱属中的许多种为抗干旱作物，在世界各干旱地区有广泛的种植。高粱属分为五个组 (section）：Stiposorghum，Parasorghum，Eusorghum，Heterosorghum和Chaetosorghum。高梁属作为 粮食、饲料、工业原料等具有很高的经济价值。其中，高粱和许多具有极强适应能力的杂草如假高粱 Sorghumhalepense（L.）Pers归于Eusorghum组，该组目前共有52个种。 黑高粱SorghumalmumParodi、光高粱S.nitidum（Vahl)Pers、苏丹草S.sudanense（Piper） Stapf.、二色高粱S.bicolor(L.）Moench、丝克高粱Silksorghum(Sorghumspp.hybrid）cv.Silk」以及拟 高粱S.propinquum（Kunth.）Hitchc.、假高粱S.halepenseL属于近似种归于Eusorghum组。黑高粱、 丝克高粱和拟高粱，它们的籽实与假高粱极为相似，但是其危害性及检疫地位各有不同。 传播途径：随交通运输工具、农具等传播到新的地区，也可通过混杂于谷物、种子和其他产品中远距 离传播。 5方法原理 根据高粱属的不同种杂草之间在ITS和trnT-trnL序列特征上的差异，应用DNA条形码技术对 检疫性高粱属（假高粱、黑高粱）进行筛查。 6仪器设备和主要试剂 6.1仪器设备 PCR仪、电子天平（1/10000g）、pHL计、冷冻混合研磨仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、 解剖镜、涡旋振荡器、冰箱。 6.2用具 PCR管、直径3.0mm灭菌钢珠等。 6.3主要试剂 植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNAMarker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核首三磷酸 （dNTPs）、Tαq聚合酶、10XPCR缓冲液。CTAB法提取试剂（参见附录A的A.1）。 7筛查鉴定方法 7.1样品的处理 将需要提取DNA的植物材料（种子为2粒～3粒，硅胶干燥的叶片为10mg），放人2ml.的EP管 中，每个管内加2粒～3粒直径3.0mm灭菌钢珠，加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨1min（30次/s）。 2 SN/T4876.4—2017 7.2DNA制备 采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的CTAB法提取植物基因组总DNA。改良的 CTAB法方法参见A.2。 7.3DNA条形码基因片段扩增 利用ITS和trnT-trnL的引物进行序列扩增，引物序列、反应体系和反应条件见附录B。 7.4PCR产物的检测 取PCR产物5μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。ITS1 引物可得到约750bp左右的扩增片段，trnT-trnL引物可得到1000bp左右的扩增片段。 7.5测序与序列处理 7.5.1测序 取剩余的PCR扩增产物45μL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用DNA产物纯化试剂 盒纯化并测序。测序引物与PCR扩增引物相同。 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列。 7.5.2比对 ITS引物扩增的PCR产物，经处理后得到615bp-616-bp大小的片段：trnT-trnL扩增的PCR产 物，经处理后得到721bp-722bp大小的片段。引物处理后的片段测序结果进人NCBI。登录NCBI数 据库BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对获得的序列进行比对。 8结果判定 8.1假高梁的结果判定 基于ITS序列，若序列相似性为100%，则判定为假高粱；若序列相似性为99%，可使用SN/T1362 假高粱检疫鉴定方法进行进一步确定，若序列相似性小于99%，则判定不是假高粱。 假高粱ITS序列参见附录C的表C.1。 8.2黑高梁的结果判定 基于trnT-trnL序列,若序列相似性为100%，则判定为黑高粱；若序列相似性小于100%，则判定 不是黑高粱。 黑高粱trnT-trnL序列参见表C.2。 9标本与原始数据保存 9.1标本保存 将最终鉴定为检疫性目标物种的植物组织或DNA置于一20℃低温保存。并注明米源，寄主，采集 时间、地点及采集者，保存期为1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则须保存到纠纷解决完毕。 3