SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4876.3—2017 DNA条形码方法 第3部分：检疫性卷蛾 MethodforDNAbarcodeg- Part 3:Quarantine species of Tortricidae 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4876.3—2017 前言 SN/T4876《DNA条形码方法》共分为5个部分 第1部分：检疫性乳白蚁； 第2部分：检疫性断眼天牛； 第3部分：检疫性卷蛾； 一第4部分：检疫性高粱属； —第5部分：曼陀罗属。 本部分为SN/T4876的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：钱路、安榆林、徐森锋、李艳华、叶兼菱、廖力、张卫东、徐梅、梁照文、李健、 汤晓军、伏建国。 I SN/T 4876.3—2017 DNA条形码方法 第3部分：检疫性卷蛾 1范围 SN/T4876的本部分规定了我国检疫性卷蛾的DNA条形码检测鉴定方法。 本部分适用于我国进境植物检疫性卷DNA条形码的测定，结果的比对分析与判定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是多不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 DNAbarcodes - 段短的、标准化的基固片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并 容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。 3.2 凭证标本 Voucher specimens DNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核，模式 标本是用于分类学研究的凭证标本。 3.3 线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基I（cytochromecoxidasesubunit I），由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。 检疫性卷频基本信息 中文名：卷蛾 学名：Tortricidae 英文名.LeafrollerMoths,TortricidMoths 中国进境植物检疫性卷包括11种：黑头长翅卷峨Acleristariana（Fernald，1886）、荷兰石竹卷 甄Cacoecimorphapronubana（Hubner，1800)，云杉色卷蛾Choristoneurafumiferana（Clemens，1865)， 草果异形小卷蚁Thaumatotibia（Cryptophlebia）leucotreta（Meyrick，1913）、斜纹卷蛾Ctenopseustis obliquana（Walker，1863）、山桔小卷蛾Cydiajanthinana（Duponchel，1835）、樱小卷蛾Grapholita 1 SN/T4876.3—2017 （Cydia）packardiCydiapackardi（Zeller，1875）、苹果蛾Cydiapomonella（Linnaeus，1758）、杏小卷 蛾Grapholita（Cydia）prunivora（Walsh，1868）、梨小卷蛾Cydiapyrivora（Danilevsky，1947）、葡萄花 翅小卷蛾Lobesiabotrana（DenisetSchiffermuller，1775)。 目前全世界已定名的卷蛾科种类有9800余种。卷蛾科种类寄主范围广泛，大部分为重要害虫，其 幼虫常对农林生产造成严重的经济损失。 5方法原理 5 根据卷蛾的COI序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性卷蛾进行鉴定。 6 仪器设备、用具及试剂 6.1 仪器设备与用具 常规PCR仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、酸度计、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全 柜、烘箱、高压灭菌锅、解剖镜、天平（感量1/10000）、勾浆研磨器、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡震 荡器、70℃冰箱、冰箱、微量移液器（0.5μL.2μL.10μL，20μL，100μL200μL，1000μL）、PCR管 (0.2mL,0.5mL)。 6.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682要求。 提取液A（1%SDS，50mmol/LTris·Cl，25mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA）、提取液B （3mmol/LKAc）、Tris饱和酚、1×TE缓冲液、蛋白酶K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、 RNaseA、10XPCR缓冲液、脱氧核糖核 苷三磷酸（dNTPs）、E工Tαq聚合酶、引物（见表1）、DL2000 Marker、琼脂糖、溴化乙锭（EB）PCR产 物纯化试剂盒 表1 扩增引物 目标基因 引物名称 引物序列（5"3） 扩增片段 LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG CO I 658bp HCO2198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 7DNA条形码测定 7.1 核酸制备 取蛾类头部、胸部肌肉和足（大约10mg）用于DNA提取，乙醇浸泡标本可先用蒸馏水漂洗干净；将 样品置于1.5ml.离心管中，加人600μL1×TE缓冲液，于56℃温浴2h，期间间歇振荡；弃掉TE缓冲 液，加人200μL提取液A（含1%SDS，50mmol/LTris·Cl,25mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA），放 入匀浆研磨器研磨充分，振荡混匀后于65℃孵化45min取出后加人等体积提取液B[3mmol/.KAc （pH7.2），上下颠倒混匀后（动作要轻）于冰上放置1h；12000r/min离心15min，取上清液至新的 1.5mL离心管中，加人2倍体积冰冻无水乙醇混匀放置一20℃冰箱1h沉淀DNA；12000r/min离心 15min，弃上清，加人1mL75%酒精洗涤沉淀，12000r/min离心10min，晾干酒精后用100μL双蒸 水溶解沉淀，一20℃保存备用。 2 SN/T 4876.3—2017 该核酸制备也可采用DNA提取试剂盒法。 7.2 DNA纯度与浓度的测定 用核酸白分析测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的 纯度和浓度，计算公式如下！ DNA纯度=0D260/OD280 DNA浓度=50×OD260μg/mL PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.7~1.9 7.3PCR扩增与序列测定分析 7.3.1 PCR扩增 PCR扩增反应为50μL每管，每体系分别加人510XPCR缓冲液（含Mg+）、4μL的dNTP.混 合物（各10mmol/mL）、上下游引物各2pL（10μmol/mL）LrTaqDNA聚合醇1μL（5U/μL），最后加 94℃5min预变性：5个循环（94C60 45c90s. 90s).30个循环（94℃60s,50℃60$， 72℃60s）；最后72℃5min延伸靠束后产物于+C冰箱保存 7.3.2 琼脂凝胶电泳 取5=LPCR产物，在1.5%我精概膜 五进行电袜EB染色，凝胶成像系统观察、 拍照。 7.3.3 PCR产物回收和克隆测序 取剩余PCR扩增产物45μL 使用DN A产物纯化回收试剂盆纯化回收产物，进行克隆测序。 7.3.4 DNA序列数据的处理 使用DNA测序仅对目的条初进行 欠向测序TCR扩增引物作为序引物，测序原理同Sanger测 序法。为确保测序结果的可靠性，对测序质 量进行评 估，专除测序结果两端的低质量序列，质量评估 以碱基的Q值为依据。应用软件是行序则拼接，去除引物区，获得相应的DNA序列，序列方向应与 PCR扩增正向引物方向一致。 8 结果判定 8.1 中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统判定 登录中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统http：//www.qbol.org.cn，点击“物种识别"导航 条，进人物种识别页面。在鉴定框内输人FASTA格式（或纯文本格式》序列后，点击"提交鉴定”，系统 进行BLAST后，自动生成鉴定结果。相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上， 可明确判定为该物种（参见附录A）；否则请辅以其他鉴定方法。 8.2 国际通用数据库判定 登录GenBank数据库BLAST鉴定系统(http：//blast,ncbi,nlm,nih.gov/Blast.cgi)，在BLAST结 果中查看序列相似性最高的物种，COI基因序列结果与已知卷蛾种类基因序列相似性最高，相似度最 高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上，可明确判定检出相应的卷载种类。常见的检疫 3 SN/T 4876.3—2017 性卷蛾种类COI基因序列表信息参见附录B。 8.3植物有害生物检疫鉴定系统判定 登陆植物有害生物检疫鉴定系统（http：//www，exoticorganism.com/），使用基因条码分析软件对 查询序列进行分析比对，通过比对数据库中的鉴定特征，将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的 物种判定为该未知种。“植物有害生物检疫