SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4876.2—2017 DNA条形码方法 第2部分：检疫性断眼天牛 Method for DNA barcodePart2:QuarantineTetropium spp. 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4876.2—2017 前言 SN/T4876《DNA条形码方法》共分为5个部分： 第1部分：检疫性乳白蚁； 第2部分：检疫性断眼天牛； 第3部分：检疫性卷蛾； 一第4部分：检疫性高梁属； —第5部分：曼陀罗属； 本部分为SN/T4876的第2部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：徐梅、钱路、吴晶、禹海鑫、叶兼菱、季琴琴、朱林娟、杨晓军、郑斯竹、安榆林。 I SN/T 4876.2--2017 DNA条形码方法 第2部分：检疫性断眼天牛 1范围 SN/T4876的本部分规定了我国检疫性断眼天牛的DNA条形码检测鉴定方法。 本部分适用于我国进境植物检疫性断眼天牛DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2013暗褐断眼天牛检疫鉴定方法 3术语和定义 3 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 DNAbarcode 段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并 - 容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。 3.2 凭证标本 voucherspecimen DNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。模式 标本是用于分类学研究的凭证标本。 3.3 COI基因 dasesubunitI），由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系 统关系。 4 检疫性断眼天牛基本信息 中文名：断眼天牛 学名：Tetropiumspp. 分类地位：鞘翅目Coleoptera，叶甲总科Chrysomeloidea，天牛科Cerambycidae，断眼天牛属Tet- ropium 断眼天牛是一类重要的蛀干害虫，该属中的绝大多数种类均严重危害针叶木，偶尔也可危害阔叶 木。其主要分布于欧亚大陆及美洲，在古北区分布有7种，北美有6种。我国检疫性断眼天牛种类主要 有暗褐断眼天牛（T.fuscum）、棕翅断眼天牛（T.cinnamopterum）、落叶松断眼天牛（T.gabrieli）、施氏 1 SN/T4876.2—2017 断眼天牛（T.schwarzianum）、铁杉断眼天牛（T.uelutinum）、小红棕断眼天牛（T.paruulum）等。 5方法原理 根据断眼天牛的COI序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性断眼天牛进行鉴定。 6仪器用具和试剂 6.1仪器 常规PCR仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、测序仪高速冷冻离心机、生物安全柜、烘 箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平（感量1/10000）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡震荡 器、冰箱、微量移液器（2μL，10μL,20μL100μL.200μL,1000μL)、PCR管（0.2ml.0.5mL）。 6.2 2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 提取液A（含1%SDS，50mmol/L提取液B3mmot/LKAc，Tris·Cl，25mmol/LNaCl，25mmol/L EDTA）、5mol/L醋酸钾（KAc）、Tis饱和酚、蛋白酶K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、液氮、 10×PCR缓冲液、脱氧核糖核苷磷酸（dNTPs）、ExTag聚合酶、引物（见表1）、DL2000Marker、琼脂糖、漠 化乙锭（EB）。 7DNA条形码鉴定 7.1核酸的制备 采用磁珠法提取基因组DNA。提取步骤为：将酒精浸泡的虫体，选择适当大小的肌肉组织，用双蒸 水进行冲洗，去除残余的酒精，冲洗干净后，将组织进行研磨，加人180uL裂解液及20uL蛋白酶K， 55℃温浴，使得组织完全裂解 人200L缓冲液、200μL无水乙醇及20μL磁珠，使DNA吸附 再加 到磁珠上，使用500μLWash r进行除杂，之后加人20uL的ElutionBuffer将DNA溶解，得到基 Buffer 因组DNA溶液，于-20℃保存 7.2DNA纯度与浓度的测定 用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的 纯度和浓度，计算公式如下： DNA纯度=OD260/OD28) DNA浓度=50XOD26μg/mL PCR级DNA溶液的OD260/OD28比值应为1.7~1.9。 7.3PCR检测 7.3.1PCR扩增引物 PCR扩增推荐使用巢式引物：J173/N1331为第1轮引物，J1718/N2191为第2轮引物。见表1。 2 SN/T4876.22017 表1扩增引物 日标基因 引物序列 扩增片段 J173(5'-TAACAGCACATGCTTTTGTA-3') 1 000 bp N1331(5'-GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3) J1718(5'-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3') 470 bp N2191(5'-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3') 7.3.2PCR扩增体系和反应条件 PCR扩增采用25μL标准反应体系：10X反应缓冲液2.5L.25mmo /L的MgCl，2μL10mmolL的 dNTPs2μL，TaqDNA聚合酶1U ，上游引物为0.5L下游引物为0.5 LDNA模板1μ，后加ddH 至终体积25μl。反应条件为：94℃预变性2min；进入循环，94℃变性30s，第1轮引物退火温度为 55℃/第2轮引物退火温度为47℃30S.72℃延 伸1min.35 循环；72℃延伸10min。 7.3.3琼脂凝胶电泳 反应结束后取扩增产物5μL，采用1.5%的琼脂糖凝胶.1X电泳缓中液TAE.在稳压150V下电泳 约30min，EB染色，凝胶成像系统观察、拍照 7.3.4测序 使用DNA测序仪对目的条带进行双 测序，PO CR扩增引物作为测序引物，测序原理同Sanger测 序法。为确保测序结果的可靠性，需 质量进行评估，去除测序结果两端的低质量序列，质量评估 以碱基的Q值为依据。应用软件进行序列拼接，去除引物区，获得相应的DNA序列，序列方向应与 PCR扩增正向引物方向一致。 8结果判定 8.1 中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统判定 登录中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系 统http： www.qbol.org.cn，点击"物种识别”导航 条，进入物种识别页面。在鉴定框内输入FASTA格式（或纯文本格式）序列后，点击“提交鉴定”，系统 进行BLAST后，自动生成鉴定结果。相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以 上，可明确判定为该物种（参见附录A）；否则辅以SN/T2013等其他鉴定方法。 8.2国际通用数据库判定 登录GenBank数据库BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，在BLAST结 果中查看序列相似性最高的物种，COI基因序列结果与已知卷蛾种类基因序列相似性最高，相似度最 高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上，可明确判定检出相应的断眼天牛种类。常见的 检疫性卷蛾种类CO)I基因序列表信息参见附录B。 8.3植物有害生物检疫鉴定系统判定 登陆植物有害生物检疫鉴定系统（http：//www.exoticorganism.com/），使用基因条码分析软件对 查询序列进行分析比对，通过比对数据库中的鉴定特征，将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的 3 SN/T 4876.2—2017 物种判定为该未知种。“植物有害生物检疫鉴定系统”操作方法参见附录C。 标本与原始数据保存 9 1标本保存 9.1 采集到的标本应无水乙醇浸渍低温保存，并注明货物来源，寄主，采集时间、地点及采集者，保存期 为1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则须保存到纠纷解决完毕。保存期满后，按后期用途长久保存或 处理。 9.2 原始数据保存 样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书须归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。 SN/T 4876.2—2017 附 录A （资料性附录） 中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法 中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法见图A.1和图A.2。 中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统 DNASARCODEAPPRAISALSYSTEMON CHINESEQUARANTINEPESTS 百员 COI4ITS) 翁入fasta格式的厚列 GGATCAAAATGATGTATTAATATTACGATCAGTTAATAGTATAGTAATACACAGCTAGTACAGGTAAGAGATAAGTATAATTTGGTATTATTACTGCTCATACAATAGCGTATTTGATCTAGGTTATAC TGTT