SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T48752017 来檬丛枝植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of Lime witches'broom phytoplasma 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 48752017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：王有福、李鑫、张婧、曹冬梅、胡强、刘卉秋、王秀芬、徐凤敏。 SN/T4875—2017 来檬丛枝植原体检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了来檬丛枝植原体的检疫和鉴定方法。 本标准适用于进境来檬苗木中来檬丛枝植原体的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1157进出境植物苗木检疫规程 3 来檬丛枝植原体基本信息 英文名：Limewitchesbroomphytoplasma 分类地位：软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales）， 非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma），16SrⅡ植原体组。 来檬丛枝植原体的其他信息参见附录A。 4方法原理 来檬丛枝植原体生物学特性和基因特性作为本标准鉴定方法的主要依据。 以组织材料症状观察、DAPI染色的形态学为初步筛查方法；以植原体核糖体16SrDNA序列特征 为主要的判定依据。 5 仪器设备和主要试剂 5.1仪器设备 定性PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、台式冷冻离心机、纯水仪、台式小型离心机、冰箱、旋涡震荡 器、微量进样器、电泳仪、水浴锅、凝胶成像系统等。 5.2用具 移液器、研钵、离心管、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等。 5.3主要试剂 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。PCR反应体系用双蒸水。其他试剂比如 各种溶液、缓冲液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录B要求准备。商品化试剂参见其使用 说明。 植物DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水、DNAmarker及DNA提取试剂等。 1 SN/T4875—2017 核酸提取研磨液（100mL)：KzHPO.·3H2O,2.17g；KHzPO，0.41g；蔗糖，10g；BSA（Fraction V)，0.15g;PVP-10,2g。pH7.6高温灭菌，4℃保存。 DNA提取液：Tris-HCl,100mmol/L;EDTA,100mmol/L;NaCl,250mmol/L;调pH至8.0。 50XTAE2.0mol/LTris,1.0mol/LNaAc,50mmol/LEDTA,pH8.0。 DAPI:4',6-二基-2-苯基吲哚。 6检测鉴定方法 6.1症状观察 6.1.1现场查验 现场对来檬苗木进行观察，症状描述参见附录A，选取可疑症状植株样品和随机样品（具体取样方 法见SN/T1157)带回实验室检测。 6.1.2DAPI染色 选取幼嫩组织（新叶叶梗、枝梢、茎秆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液染色，在 460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因 植株内植原体分布不均，故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。 6.2DNA提取 取所选新鲜材料的韧皮部及叶中脉0.3g.或干材料0.1g取适量液氮研磨，再加人研磨液2mL充 （5mg/mL），轻轻混匀，加人80μL10%十二烷肌氨酸钠，混匀，在55℃温育1h～2h，4℃6000r/min， 10min，取上清液。加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻混匀，-20℃保持至少30min，4℃12000r/min， 15min，弃上清液。加人600μLTE缓冲液，30μLSDS，12μL蛋白酶K（5mg/mL），混匀，37℃温育 30min～60min。加100μL5mol/LNaCl混匀，再加人84μLCTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育 10min。加人等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1）混匀，4℃12000r/min，5min，重复直至无中间白色 层。上清液加入2/3体积异丙醇，混勾，-20℃保持至少3min，4℃12000r/min，10min，弃上清液。 加人1mL70%乙醇洗涤，12000/min，1min。洗涤2次。加人30μLTE混匀溶解。一20℃冰冻 保存。 注：也可采用商品试剂盒提取，但通常上述方法提取的核酸质量更优 6.3通用引物PCR扩增及序列测定 用2对引物进行巢式PCR反应及凝胶电泳检测，方法见附录B。 6.4序列分析鉴定 将第二轮PCR产物（引物R16F2/R2，产物大小为1239bp)进行序列测定，在Genebank中进行序 列比对。 7结果判定 7.1形态学鉴定 表现症状与A.1描述一致且6.1.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为植 2 SN/T4875—2017 原体。 7.2 分子生物学鉴定 初步判定为植原体病害的植物材料，经6.3和6.4步骤后，出现1239bp特异性条带，且该条带测 序结果与genebank中来檬丛枝植原体（Limewitches'broomphytoplasma）的相似度达99%以上，即 可判定为来檬丛枝植原体。 82 样品保存与复核 8.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出来檬丛枝植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以 备复核。该类样品保存期满6个月后须经高压灭菌后方可处理。 8.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳照片，并附DNA测序结果，