SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4859—2017 国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定方法 Identification of Mycobacterium tuberculosis complex at frontier port 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 涂层查真伤 国 SN/T4859-—2017 #創言 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：陆晔、王健、章琪、方筠、孟成艳、叶魏、查期、贾哲甫、张晓航、韩晓辉、周娴 邱瑾。 I SN/T48592017 引言 近几年结核病实验室诊断新技术不断涌现，实现了快速而准确检测结核分枝杆菌及其耐药性的目 标。目前我国依据《WS288一2008肺结核诊断标准》进行结核病诊断，其中结核病的实验室诊断仍主要 依赖于痰标本涂片显微镜检查、传统的固体培养。显微镜检查敏感度较低，并且无法区分活性和非活性 生物体，无法鉴别分枝杆菌类型。传统的固体培养基上，结核杆菌生长需要长达八周的时间，报告时间 长。在无法及时确诊的情况下，适当的治疗被延迟。同时，实验室还需要快速而价廉的培养物鉴定方法 用以区分结核分枝杆菌复合菌群和非结核分枝杆菌。WHO在结核病诊断方面的相关标准持续改进， 将新的技术与方法恰当的纳入诊断方案，这也是有效采用新的诊断方法的先决条件之一。 本标准在充分评估的基础上，规范了结核分枝杆菌实验室鉴定技术的应用路径，及综合判断方案。 通过新技术的采用，提高了国境口岸肺结核病的防控效率。 SN/T4859—2017 国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定方法 1范围 本标准规定了国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定的生物安全要求、鉴定程序、鉴定方法、结果报告 等内容。 本标准适用于国境口岸人出境人员感染结核分枝杆菌复合群的检测鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 结核病实验室生物安全手册世界卫生组织 人间传染的病原微生物名录 卫生部 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 结核分枝杆菌复合群Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTO 传染性结核病的病原菌复合群.包括结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆 菌。MTC的细菌呈杆状，菌体大小0.6/μm×（lum～4μm），抗酸染色阳性，革兰氏染色阳性。生长缓 慢，约10h繁殖一代，据接种量的多少，10d~30d肉眼可见菌落生长。罗氏（Lowenstein-Jensen）培养 基上的菌落粗糙、致密，呈颗粒、结节或菜花样，乳白或米色，不透明。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PAGE（polyacrylamidegelelectrophoresis）：聚丙烯酰胺凝胶电泳 TBE（Tris-Boricacid）：Tris-硼酸核酸电泳缓冲液 bp(basepair）：碱基对 5生物安全措施 根据WHO《结核病实验室生物安全手册》与GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的要求，结 核分枝杆菌复合群相关检测鉴定材料的生物安全要求如下： 样本处理与检测应于生物安全二级（BSL-2)实验室，在IIA级或以上级别生物安全柜内进行； 一大量活菌操作，如培养物鉴定，药敏检测等，应在生物安全三级（BSI-3)实验室或结核病防护 实验室内的生物安全柜中进行。结核病防护实验室，是指在生物安全二级实验室基础上，实验 SN/T4859—2017 区域与实验室外部由缓冲区域物理隔离，实验区域控制为单向气流； -MTC的细菌培养物运输包装分类为A类，UN编号为UN2814； 操作人员佩戴医用N95口罩，穿着一次性防护服，戴一次性医用橡胶手套，更换防水工作鞋； 操作人员需要每年进行胸部X光检查、血清HIV检查。 6 仪器和设备 6.1ⅡI级生物安全柜。 6.2电子天平。 6.3水平冷冻离心机（离心力3500g以上）。 6.437℃恒温培养箱。 6.5 荧光PCR仪。 6.6水平电泳仪。 6.7 紫外成像仪。 6.8 3100℃热浴仪。 6.9 正置光学显微镜。 6.10 微量加样器（2μ、20μl、200μL、1000μ）。 7 试剂和耗材 7.1 PCR反应体系（商品化试剂）。 7.2 0.067mmol/L，pH6.8磷酸缓冲液（PBS）。 7.3 N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC)。 7.4 无菌4%NaOH溶液。 7.5 无菌2.9%枸橡酸钠溶液。 7.6 苯。 7.7 无水乙醇。 7.8 罗氏培养基。 7.9 革兰氏染色液。 7.10 抗酸染色液。 7.11 TBE电泳缓冲液。 7.12 DNA分子量标准（DNALadderMarker）。 7.13 50mlL无菌离心管。 8 实验室检查 8.1 生长周期检查 8.1.1 罗氏培养基上MTC的生长周期 痰标本中的MTC在罗氏培养基上生长.通常第3周以后开始出现肉眼可见的菌落 8.1.27H9液体培养基中MTC的生长周期 8.1.2.1 痰标本中的MTC在7H9液体培养基中生长，通常第14天左右出现显微镜下可见的菌落。 2 SN/T4859—2017 8.1.2.2痰标本中的MTC数量多、繁殖旺盛时，接种后第4天左右出现显微镜下可见的菌落。通常液 体培养样本接种后立即报告阳性的为其他污染细菌。 8.2形态学检查 肉眼观察罗氏培养基上的菌落。MTC在罗氏培养基上是乳白或米色、不透明、粗糙、致密，呈颗 粒、结节、或菜花样的菌落，单个菌落散在或聚集，参见图A.1和图A.2，也可见细小的菌落连成一片 菌苔。 8.3抗酸染色检查 8.3.1痰涂片的抗酸染色及检查 痰涂片抗酸染色后在1000倍放大的正置光学显微镜下MTC呈红色的细长杆菌。部分红色菌体 中可见浓染颗粒。可以一条散在，也可多条聚集，也可成团或成簇。参见图A.3和图A.4。 8.3.2罗氏培养基上MTC的抗酸染色及检查 菌，密集成团。参见图A.5。 8.3.3液体培养基7H9中MTC的抗酸染色及检查 液体培养基中的MTC涂片抗酸染色后，在1000倍放大的正置光学显微镜下呈致密、条索状的红 色菌团。参见图A.6。 8.4免疫学鉴定方法 通过对液体培养基中MPB64分泌蛋白的检测，能够确定培养基中是否含有结核分枝杆菌复合群。 选用国家食品药品监督管理总局（CFDA)注册认证的商品试剂盒，按照说明书进行检测。 8.5分子生物学鉴定方法 8.5.1MTC的实时荧光PCR检查 通过对痰液样本或培养物中结核分枝杆菌特异性核酸片段的检测，鉴定样本中是否含有结核分枝 杆菌复合群。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA)注册认证的商品试剂盒，按照说明书进行检测。 8.5.2MTC的线性探针杂交固相膜显色检测 通过扩增结核分枝杆菌16SrRNA特异性片断，扩增产物经过化学变性后，与带有探针固化的试纸 条杂交，通过显色反应检测确定是否含有目的片段。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认 证的商品试剂盒，如：HainLifescience公司的GenoType(r）MTBDRplus，按照说明书进行检测。 8.5.3MTC的DNA序列测定及比对 参见附录B。 8.5.4MTC核酸及rpoB基因突变检测 检测结核菌阳（涂片阳性或者细菌培养阳性)痰沉淀物样本中的结核分枝杆菌复合群特异性核酸片 段和利福平耐药相关的rpoB基因突变，完成分枝杆菌鉴定及利福平耐药分析。选用国家食品药品监督 管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，如：Cepheid公司的XpertMTB/RIF"，按照说明书进行 3