SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4853.1—2017 数字PCR法 转基因大米定量检测 第1部分：TT51-1品系 Quantitative detection of geneticallymodified rice-Digital PCR- Part1:EventTT51-1 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4853.1—2017 前言 SN/T4853《转基因大米定量检测 数字PCR法》系列标准共分为7部分： 一第1部分：TT51-1品系； 第2部分：克稻品系； 第3部分：科丰6号品系； 第4部分：M12品系； 第5部分：LL62品系； 一第6部分：T2A-1品系； 一第7部分：TTC-19品系。 本部分为SN/T4853的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共 和国吉林出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：陈颗、黄文胜、邓婷婷、聂丹丹、朱水芳、吴亚君、付伟、李想、韩建勋。 I SN/T4853.1-2017 转基因大米定量检测 数字PCR法 第1部分：TT51-1品系 1范围 SN/T4853的本部分规定了谷和大米中TT51-1品系的数字PCR定量检测方法。 本部分适用于谷和大米中TT51-1品系特异性的数字PCR定量检测。 本方法的定量检测低限（LOQ）为0.1%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义 GB/T19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T19495.5 转基因产品检测 核酸定量PCR检测方法 GB/T19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法 SN/T1194 植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法 3术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 SPS基因 the gene of sucrose phosphate synthase 蔗糖磷酸合成酶基因，大米单拷贝内参照基因。 3.1.2 TT51-1转化体特异性序列 Jevent-specificsequenceofTT51-1 外源DNA插人受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。 3.1.3 Taq酶TaqDNApolymerase 源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。 3.1.4 模板 template 数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。 3.1.5 定量检测低限 limitofquantification;LOQ 在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量。 1 SN/T4853.1—2017 3.1.6 质控样品 qualitycontrolsample 具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的TT51-1转化体基因组DNA。 3.1.7 微反应体系 tinyreactionsystem 将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀之后分配至体积相同且相互 物理隔离的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系 3.1.8 转换系数 conversion factor 将转化体特异性序列和内参照基因拷贝数之比转换为转基因成分含量（W/W）时所用系数。 3.1.9 荧光标记探针 ffluorescentlytaggedprobe 在5'末端和3末端分别连接荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。PCR扩增时，Taq酶的5-3” 外切酶活性将探针水解，使报告基团和淬灭基团分离，从而释放出荧光信号。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 数字PCR：数字聚合酶链式反应（digitalpolymerasechainreaction） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） bp：碱基对（basepair） NC：阴性对照（negaitivecontrol) NTC空白对照（notemplatecontrol) PC：阳性对照（positivecontrol) 防污染措施 数字PCR定量检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。 5原理 数字PCR(digitalPCR)是在荧光PCR基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板 的绝对拷贝数的测定。通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反 应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于10000个）微反应体系，使每个模板独立随机 地分配至微反应体系中；所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定 的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果；依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字 PCR反应体系中的模板浓度。 依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列（eventspecificsequence）和内参照基因（species specificgene)的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因品系含量。 6仪器和设备 6.1 超纯水发生器（分子生物学级别）。 2 SN/T4853.1—2017 6.2 分析天平：感量0.1g和0.1mg。 6.3 生物安全柜。 6.4 PCR扩增仪。 6.5 数字PCR系统：微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具 有同样功能的仪器。 6.6 恒温孵育箱：控温精度士1.0℃。 6.7 样品粉碎机：可将大米或稻谷样品磨成60目左右的粉末。 6.8 核酸定量仪：Nanodrop30oo或Modulus检测仪或其他核酸定量检测仪。 6.9 涡旋振荡仪。 6.10 离心机：最大离心加速度大于15000g，并适用0.2mL和1.5mL离心管。 6.11 移液枪：量程0.5μL~10μL；量程10μL~100μL；量程100μL~1000μL。 7 试剂和材料 除另有规定外，试剂和材料质量应符合GB/T19495.1的要求， 7.1 实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 7.2 数字PCR预混液：含有镁离子、dNTPs和具有5'-3'外切活性的热启动TaqDNA聚合酶的数字 PCR专用预混试剂。 7.3 7.4 数字PCR微反应体系生成联排管或芯片。 7.5 96孔荧光定量PCR反应板和封膜。 7.6 0.2mL和1.5mL离心管。 7.7 移液枪头，量程0.5μL~10μL；量程10μL~100μL；量程100μL~1000μL。 表1SPS基因和TT51-1转化体特异性序列的引物和探针 PCR扩增 扩增基因 名称 序列(5"-3") 片段长度 上游引物 GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTG SPS基因 下游引物 GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC 122 bp 探针 VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1 上游引物 CTAGAGGATCCCGGACGAGTG TT51-1转化 下游引物 ATGAGTGGTAGCGTCCAGAAGGAAA 90bp 体特异性序列 探针 FAM-CTGGGGCAGATAAGCAGTAGTGGTGGG-BHQ1 注1：表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调整。 式标记。 注3：新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至 10μmol/L后分装，-20℃避光保存。 3 SN/T 4853.1—2017 8 实验步骤 8.1 抽样 按照GB/T19495.7的规定执行。 8.2 样品制备 除另有规定外，样品制备按照GB/T19495.7或SN/T1194的规定执行。 将样品适度破碎、均一化，取出至少200g，全部放人样品研磨机中，研磨至60目左右粒度。破碎和 研磨过程中应凋整设备的操作参数，避免过热并防止样品粘连。 8.3 核酸提取纯化 8.3.1 核酸提取及PCR抑制物的判断 除另有规定外，DNA提取纯化及PCR抑制物的判断按照GB/T19495.3中的规定执行。 称取2份（每份2g）研磨后样品作为测试样，分别提取基因组DNA。 8.3.2 模板浓度控制 采用PicoGreendsDNA荧光定量试剂盒或其他具有等效结果的仪器/方法测定DNA溶液的浓度， 具体操作步骤参照相关仪器/试剂盒说明书。 数字PCR体系中的模板数应不高于微反应体系数的5倍。为保证定量结果的准确性，体系中总模 板数应不低于400个拷贝。将样品DNA溶液作适度稀释，选择模板浓度在100拷贝/μL～20000拷 贝/μL范围内的稀释液分别用于SPS基因拷贝数和转化体特异性序列拷贝数的数字PCR定量检测。 数字PCR扩增 8.4 8.4.1 数字PCR体系配制 按表2将各组分加入洁净离心管中，充分混匀。 表2数字PCR反应体系 试剂 终浓度 内源基因反应