SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4849.6—2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法 实时荧光PCR法 第6部分：猕猴桃 Identificationof theingredientsof common smallberry fruits in food and juice for export-Real-time PCR method- Part 6:Kiwi 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4849.6—2017 前言 SN/T4849《出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法 实时荧光PCR法》系列标准共分为 6部分： 第1部分：蓝莓； 一第2部分：树莓； 第3部分：黑加仑； 第4部分：桑甚； 第5部分：蔓越莓和蓝莓； 第6部分：猕猴桃。 本部分为SN/T4849的第6部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院 本部分主要起草人：陈颖、邓婷婷、黄文胜、吴亚君、杨艳歌、刘鸣畅、韩建勋、张九凯、王斌。 I SN/T4849.6—2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第6部分：猕猴桃 1范围 SN/T4849的本部分规定了出口食品及饮料中猕猴桃成分的检测方法实时荧光PCR法。 本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜钱、鲜榨果汁、果肉型果汁、果于、果酱等以猕猴桃为原辅料的初加工 食品及饮料中猕猴桃成分的定性检测（清汁及果酒除外）。本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为 1%（体积比）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 小浆果smaiiberryfruits 浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成。小 浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。 3.1.2 猕猴桃 kiwi 红色的种子。拉丁文名：ActinidiaChinensis。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）。 PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）。 Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）。 dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）。 dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）。 1 SN/T4849.6—2017 dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）。 dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）。 UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）。 Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris(Hydroxymethyl)aminomethane]。 EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid)。 Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus）。 OD：光度密度（opticaldensity）。 4方法提要 果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提 取DNA。以猕猴桃果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异 性引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在猕猴桃成分。 5试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 5.1检测用引物和探针：猕猴桃成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因)引物和探针详见 表1。猕猴桃引物扩增的靶标序列参见附录A。 表1 猕猴桃序列引物探针 扩增片 物种名称 引物/探针序列(5'-*3') 靶基因 段长度 F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA NADH dehydrogenase 内参照 R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp subunit B(ndhB)gene P:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 F:GCCCCATGGGTGACACTCT Internal Transcribed 猕猴桃 R:AAGTTCCTTGACGCGTTTCG 69 bp Spacer(ITS)gene P:FAM-CCGGTCAAACAACGAACCCCGG-BHQ1 5.2 三氯甲烷（氯仿）。 5.3异丙醇。 5.4CTAB提取缓冲液:20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LN.zEDTA， pH 8.0。 5.5 CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。 5.670%乙醇（体积分数）。 5.7 蛋白酶K（20mg/mL）。 5.8实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U～2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1X PCRbuffer、2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg+、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A,C,G) TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料。 2 SN/T 4849.6—2017 5.9 910×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4)，200mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2 6 仪器设备 6.1 实时荧光PCR仪。 6.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.3 恒温水浴锅。 6.4 离心机：最大离心力不小于12000g。 6.5 微量移液器：0.5μL~10μL，10μL~100μL，20μL～200μL，200μ~1000μL。 6.6 粉碎装置。 6.7 涡旋震荡器。 6.8 pH计。 6.9 量筒：容量50mL。 6.10 烘箱。 7检测步骤 7.1 样品前处理 鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分。 果干、果酱、蜜钱类样品先用蒸馏水清洗3次，再粉碎。 果汁样品取适量15000r/min离心30min，取沉淀部分。 7.2DNA提取 取粉碎后的样品50mg200mg，加入1mL裂解液，同时加人0.01倍体积的20mg/mL蛋白酶 K，65℃温育1h～2h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加人适量CTAB 提取缓冲液；取出后12000r/min离心10min，转移上清至2mL离心管中，加入0.7倍体积的三氯甲 积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min；转移上清至干净离心管中，加人等体 积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h；弃上清，加人350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀；加入 4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。 加人5μL～100μL双蒸水，室温10min，混匀，一20℃保存。 上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取。 7.3 3DNA浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。 DNA的浓度按照式(1)计算： c=AXN×50/1000 ..(1) 式中： -DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）； A——260nm处的吸光值； N- 核酸稀释倍数。 3 SN/T4849.62017 当A260/A280比值在1.7～2.0之间时，适宜于PCR扩增。 7.4实时荧光PCR扩增 7.4.1 每个试样PCR反应应设置3个重复。 7.4.2 实时荧光PCR反应体系见表2。 表2实时荧光PCR反应体系 试 剂 体 实时荧光PCR反应混合液 12.5 μL 正向引物(10μmol/L) 1.0 μL 反向引物（10μmol/L) 1.0 μL 探针(10μmol/L) 0.5 μL DNA模板（5ng/μL) 5.0 μL 灭菌ddH20 5.0 μL 7.4.3实时荧光PCR反应程序按如下条件进行。50℃2min;95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min， 40个循环。 7.5对照反应 7.5.1所有试样均应同时设置平行的内参照检测与桑甚特异性检测，各体系中除引物探针外，其余组 分及反应条件均与7.4一致。 7.5.2在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照，各对照反应体系中，除模板 外，其余组分及反应条件应与7.4一致。 质量控制 8 以下条件有一条不满足时，实验视为无效： a