SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4849.2—2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法 实时荧光 PCR法 第2部分：树莓 Identification of the ingredients of common small berry fruits infoodandjuiceforexport-Real-timePCRmethod- Part 2 : Raspberry 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4849.22017 前言 SN/T4849《出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法 实时荧光PCR法》系列标准共分为6 部分： 第1部分：蓝莓； 第2部分：树莓； ——第3部分：黑加仑； 一第4部分：桑葚； 第5部分：蔓越莓和蓝莓； 一第6部分：猕猴桃。 本部分为SN/T4849的第2部分。 本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本部分主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、邓婷婷、黄文胜、刘鸣畅、王斌、张九凯、韩建勋。 I SN/T 4849.2—2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第2部分：树莓 1范围 SN/T4849的本部分规定了出口食品及饮料中树莓成分的检测方法实时荧光PCR法。 本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜饯、鲜榨果汁、果肉型果汁、混浊汁、果干、果酱、及其他以树莓为原辅 料的食品及饮料中树莓成分的定性检测（清汁及果酒除外），包括红树莓、黄树莓、黑树莓。此部分所规 积比）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T27657—2011树莓 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 小浆果 smallberryfruits 浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成。小 浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。 3.1.2 树莓raspberry 根据GB/T27657一2011描述，树莓是蔷薇科悬钩子属植物的果实，聚合果，形状有圆头形、圆锥形 和半球形等，根据颜色分为红树莓（Rubusidaeus）、黄树莓（Rubusramhocarpus）、黑树莓（Rubusocci dentalis）、紫树莓（Rubusneglectus）4个种群。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 1 SN/T4849.2—2017 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三羟甲基氨基甲烷［Tris(Hydroxymethyl)aminomethane] EDTA乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus） OD：光度密度（opticaldensity） 4 方法提要 果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提 取DNA。以树莓果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异性 引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在树莓成分。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装、 5.1 检测用引物和探针：树莓成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见 表1。树莓引物扩增的靶标序列参见附录A。 表1 树莓序列引物探针 扩增片 物种名称 引物/探针序列（5'-→3') 靶基因 段长度 F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA NADH dehydrogenase 内参照 R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp subunit B(ndhB)gene P:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 F:GTTATTCGTTGGAACCGTAGGAA NADH dehydrogenase 树莓 R:GACTGAAAAAACTGCATTTGTGA 160 bp (ndhF)gene P:FAM-ATTATCCAAATTGTTAACCCCGTCCATAAACCT -TAMAR 5.2 三氯甲烷（氯仿）。 5.3 异丙醇。 5.4 CTAB提取缓冲液：20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNazEDTA， pH 8.0. 5.5 CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。 5.6 70%乙醇（体积分数）。 5.7 NaCl溶液(1.2mol/L)。 2 SN/T 4849.2—2017 5.8蛋白酶K(20mg/mL）。 PCRbuffer、2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg2+、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A,C,G) TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料。 10XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2。 5.10 仪器设备 6.1 实时荧光PCR仪。 6.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.3 恒温水浴锅。 6.4 离心机：离心力≥12000g。 6.5 微量移液器：0.5μ~10μ，10μ~100μ，20μ～200μ，200μ1000μ。 6.6粉碎装置。 6.7 涡旋振荡器。 6.8pH计。 6.9 量筒：容量50mL。 6.10 烘箱。 7 检测步骤 7.1样品前处理 鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分。 果干、果酱、蜜钱类样品先用蒸馏水浸泡清洗3次，再粉碎。 果汁样品取适量15000r/min离心30min，取沉淀部分。 2DNA提取 7.2 CTAB提取缓冲液；取出后12000r/min离心10min，转移上清至2mL离心管中，加人0.7倍体积的 三氯甲烷，剧烈振荡混匀，12000r/min转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，再加入 0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈振荡混匀，室温下12000r/min离心10min；转移上清至干净离心管中，加 入等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h；13000r/min的转速离心10min；弃上清，加人350μL 1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀；加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积一20℃冰箱中预冷的无水 乙醇混勾，一20℃放置30min，12000r/min4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次， 12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加人50μL～100μL双蒸水，室温10min，混匀， 20℃保存。 上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取， 7.3DNA浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。 DNA的浓度按照式(1)计算： SN/T4849.2—2017 c=A×N×50/1000 ·(1 ) 式中： DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）； A- -260nm处的吸光值； N-—核酸稀释倍数。 当A260/A280比值在1.7～2.0之间时，适宜于PCR扩增。 7.4 实时荧光PCR扩增 7.4.1 每个试样PCR反应设置3个重复 7.4.2 实时荧光PCR反应体系见表2。 表2实时荧光PCR反应体系 试剂 体积 实时荧光PCR反应混合液 12.5 μL 正向引物（10μmol/L) 0.5 μL 反向引物（10μmol/L) 0.5 μL 探针(10μmol/L) 0.5 μL DNA模板(5ng/μL100ng/μL) 5.0 μL 灭菌ddH,（) 6.0 μL 7.4.3实时荧光PCR反应程序按如下条件进行。内参和树莓ndhF基因均为：50℃2min；95℃预变 性10min;95℃15s，60℃1min，40个循环。 7.5对照反应 7.5.1所有试样均应