SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4849.1—2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第1部分：蓝莓 Identification of tne ingredients of common small berry fruits food and juice for export-Real-time PCR method-Part 1:Blueberry 2018-03-01实施 2017-07-21发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4849.1—2017 前言 SN/T4849《出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法 实时荧光PCR法》系列标准共分为 6部分： 一第1部分：蓝莓； 第2部分：树莓； 第3部分：黑加仑； 第4部分：桑甚； 一第5部分：蔓越莓和蓝莓； -第6部分：猕猴桃。 本部分为SN/T4849的第1部分。 本部分按照GB/T1.1---2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本部分主要起草人：陈颖、杨艳歌、吴亚君、邓婷婷、黄文胜、张九凯、韩建勋、刘鸣畅、王斌。 I SN/T4849.1—2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第1部分：蓝莓 1范围 SN/T4849的本部分规定了出口食品及饮料中蓝莓成分的检测方法实时荧光PCR法。 本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜饯、鲜榨果汁、果肉型果汁、混浊汁、果干、果酱、及其他以蓝莓为原辅 料的食品及饮料中蓝莓成分的定性检测（清汁及果酒除外）。本部分所规定方法的最低检出限（LOD） 为1%（体积比）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T27658—2011蓝莓 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 小浆果smallberryfruits 浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成。小 浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。 3.1.2 蓝莓blueberry 根据GB/T27658一2011描述，蓝莓是杜鹃花科越橘属植物中蓝果类型的果实，小浆果，近圆形或 圆扁形，并披一层白色果粉，果肉细腻，种子极小。拉丁学名：Vacciniumspp.，分为免眼蓝莓 （Vacciniumvirgatum）、高丛蓝莓（VacciniumcorymbosumL.）（分南高丛蓝莓、北高丛蓝莓2种）、半高 丛蓝莓（VacciniumangustifoliumXVacciniumcorymbosum）矮丛蓝莓（Vacciniumangustifolium）五 个品种群。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） 1 SN/T4849.1—2017 Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris(Hydroxymethyl)aminomethane] EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus） OD：光度密度（opticaldensity） 4 方法提要 果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、密钱先用蒸馏水清洗再提 取DNA。以蓝莓果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异性 引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在蓝莓成分。 5试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 5.1检测用引物和探针：蓝莓成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见 表1。蓝莓引物扩增的靶标序列参见附录A。 表11 蓝莓序列引物探针 扩增片段 物种名称 引物/探针序列（5'-→3"） 靶基因 长度 F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA NADH dehydrogenase 内参照 R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp subunit B(ndhB)gene P:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 F:AGCAACATGACGTCATATATCCACT 蓝莓 R:GAATACAAATTTGTATTGTACCCCA 244 bp maturase K(matK)gene P:FAM-TGCACTTGCTCATGATCGTGGTTTAAATAGATT -TAMAR 5.2 2三氯甲烷（氯仿）。 5.3异丙醇。 5.4CTAB提取缓冲液:20g/I.CTAB,1.4mol/L.NaCI,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNazEDTA， pH 8.0。 5.5 5CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/L.NaCl。 5.670%乙醇（体积分数）。 2 SN/T4849.1—2017 5.7NaCl溶液(1.2mol/L)。 5.8蛋白酶K（20mg/mL）。 5.9实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U(Unit，酶学单位）的Taq酶、1× PCRbuffer、2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg2+、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A,C,G) TPs0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料。 61 仪器设备 6.1 实时荧光PCR仪。 6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.3 恒温水浴锅。 6.47 离心机：离心力≥12000g。 6.5 微量移液器：0.5μL~10μL，10μL~100μL，20μL200μL，200μL1000μL。 6.6 粉碎装置。 6.7 涡旋震荡器。 6.8 pH计。 量筒：容量50mL。 6.10 烘箱。 7 检测步骤 7.1 样品前处理 鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分。 果干、果酱、蜜饯类样品先用蒸馏水浸泡清洗3次，再粉碎。 果汁样品取适量15000r/min离心30min，取沉淀部分。 7.2DNA提取 取50mg~500mg样品，加人1mLCTAB提取缓冲液，同时加入0.01倍体积的20mg/mL蛋白 酶K，65℃温育1h～2h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加人适量 CTAB提取缓冲液；取出后12000r/min离心10min，转移上清至2mL离心管中，加人0.7倍体积的 三氯甲烷，剧烈震荡混匀，12000r/min转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，再加人 0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min；转移上清至干净离心管中，加 人等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h；13000r/min的转速离心10min；弃上清，加入350μL 1.2mol/LNaCI溶液，充分溶解沉淀；加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积一20℃冰箱中预冷的无水 保存。 上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取。 7.3 3DNA浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A26o和A280。 3