SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4848.8—2017 出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR 法 第8部分：紫云英 Identification of common honey plant species in export honey- Real-time PCR method---Part 8:Milk Vetch 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 刮涂层立真伪 一 SN/T4848.8—2017 前言 SN/T4848《出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法》共分为8个部分： 第1部分：荆条； 一第2部分：油菜； 一一第3部分：洋槐； 一第4部分：桉树； -第5部分：搬树； 第6部分：龙眼； 一一第7部分：荔枝和龙眼； 第8部分：紫云英。 本部分为SN/T4848的第8部分。 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出人境检验检疫局、中华人民共 和国上海出境检验检疫局。 本部分主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、黄文胜、张九凯、刘鸣畅、韩建勋、宗凯、李想、王斌。 1 SN/T4848.8—2017 出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第8部分：紫云英 1范围 SN/T4848的本部分规定了出口蜂蜜中紫云英成分的实时荧光PCR检测方法。 本部分适用于出口蜂蜜中紫去英成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.1%（质量百分比）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB14963—2011食品安全国家标准蜂蜜 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蜂蜜honey 蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或密露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。 3.2 紫云英milkvetch 紫云英（AstragalussinicusL.），文名翘摇、红花草，豆科、黄者属植物。 3.3 实时荧光PCRrealtimePCR 在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始 模板的定量及定性分析。 3.4 Ct值 直cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid) SN/T4848.82017 PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三羟甲基氨基甲烷Tris(Hydroxymethyl)aminomethane] EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus） OD：光度密度（opticaldensity） FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein) TAMRA：羧基四甲基罗丹明（Carboxy-tetramethyl-rhodamine） BHQ1：黑洞猝灭基团1(Blackholequencher1) 5 方法提要 提取样品DNA，以紫云英源性DNA为阳性对照，以其他密源植物DNA为阴性对照，无菌水作为 空白对照，使用特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，观察实时 荧光PCR的增幅现象判定是否存在紫云英成分。 6试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 6.1检测用引物和探针：紫云英成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见 表1。紫云英引物扩增的靶标序列参见附录A。 表1紫云英基因扩增引物探针序列 扩增片 物种名称 引物/探针序列（5'--3°） 靶基因 段长度 F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA NADH dehydrogenase 内参照 R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp subunit B(ndhB)gene P:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQI F:CGAAATGTCAAAAGCATAAAACG NADH dehydrogenasc 紫云英 R:ATTCCATCTTGGCTGAAAGAAAT 176 bp subunit F(ndhF)gene P:FAM-TTCCAATGGACCCAACGAAGAAAGTAAATAA-TAMRA 6.2 三氯甲烷（氯仿）。 6.3 异丙醇。 6.4体积分数为70%的乙醇。 2 SN/T4848.8—2017 6.5 5NaCl溶液（1.2mol/L)。 6.6蛋白酶K(20mg/mL)。 6.7CTAB提取缓冲液:20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNazEDTA pH 8.0 6.8CTAB沉淀液：5g/LCTAB,40mmol/LNaCl。 6.910XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4)，200mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2。 6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U～2U(Unit，酶学单位）的Tag酶、1× PCRbuffer、2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg2+、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A,C,G) TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪无需ROX校正）。 7仪器设备 7.1实时荧光PCR仪。 7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 7.3 恒温水浴锅。 7.4离心机：离心力≥12000g。 7.5 微量移液器：0.5μl10μ，10μL~100μl，20μ~200μ，200μ~1000μL。 恒温混匀仪。 7.6 7.7 涡旋震荡器。 7.8 pH计。 7.9 量筒：容量50mlL。 7.10 烘箱。 8 检测步骤 8.1 DNA提取 8.1.1 蜂蜜沉淀DNA提取 8.1.1.1 蜂蜜样品50℃水浴20min至充分融化，上下颠倒混匀。 8.1.1.2取20ml蜂蜜样品，分成2管，每管10mL于50mlL离心管中，加人无菌双蒸水至30mL，涡 旋混匀，4000r/min离心10min，吸出上清（4℃贮存备用）。 8.1.1.3沉淀部分用1mL无菌水洗脱，分装于2ml离心管中，12000r/min离心5min，去除上清。 8.1.1.4 加人600μLCTAB提取缓冲液，置于65℃恒温混匀仪中温育1h2h，转速为650r/min； 12000r/min离心10min。 8.1.1.5 转移上层清液至2ml.离心管中，加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min 离心10min。 8.1.1.6 加人等体积CTAB沉淀液混匀，13000r/min离心10min。 8.1.1.7 弃上清.加人350uL1.2mol/LNaCI溶液，充分溶解沉淀。 8.1.1.8 加人0.8倍体积的异丙醇混匀，-20℃放置0.5h~1h，12000r/min转速4℃离心10min～ 15 min。 8.1.1.9 弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000r/min转速下4℃离心10min。 8.1.1.10 弃上清，室温下晾干。加人50μl100μl双蒸水，溶解沉淀，一20℃保存。 3