SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4848.22017 出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法第2部分：油菜 Identification of common honey plant species in export honey- Real-timePCR method-Part 2:Canola 2018-03-01实施 2017-07-21发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4848.2—2017 前言 SN/T4848《出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 ：实时荧光PCR法》共分为8个部分： 第1部分：荆条； 第2部分：油菜； 第3部分：洋槐； 第4部分：桉树； 一第5部分：搬树； 第6部分：龙眼； 第7部分：荔枝和龙眼； 第8部分：紫云英 本部分为SN/T4848的第2部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、 本部分主要起草人：吴亚君、陈颖、刘鸣畅、杨艳歌、张九凯、韩建勋、王斌、李想、黄文胜。 I SN/T4848.2—2017 出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法第2部分：油菜 1范围 SN/T4848的本部分规定了出口蜂蜜中油菜成分的实时荧光PCR检测方法。 本部分适用于出口蜂蜜中油菜成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为0.1% （质量百分比）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB14963—2011食品安全国家标准蜂蜜 GB/T27403一2018实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 蜂蜜honey 蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。 3.2 油菜canola 油菜（BrassicacampestrisL）又名油白菜、苦菜，十字花科芸蒸属植物，属十字花科白菜变种。 3.3 实时荧光PCRrealtimePCR 在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始 模板的定量及定性分析。 3.4 Ct值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate） SN/T4848.2——2017 dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris(Hydroxymethyl)aminomethane] EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus） OD：光度密度（opticaldensity） FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein） TAMRA：羧基四甲基罗丹明(Carboxy-tetramethyl-rhodamine) BHQ1：黑洞猝灭基团1(Blackholequencher1) 5方法提要 提取样品DNA，以油菜来源DNA为阳性对照，以其它蜜源植物DNA为阴性对照，无菌水作为空 白对照，采用油菜的特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象判定是 否存在油菜成分。 6试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 6.1检测用引物和探针：油菜成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表 1。油菜引物扩增的靶标序列参见附录A。 表1油菜基因扩增引物探针序列 扩增片段 物种名称 引物/探针序列（5'->3'） 靶基因 长度 F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA NADH dehydrogenase 内参照 R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp subunit B(ndhB)gene P:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 F:GAGGATAACCCCGCACTAGC cryptochrome 2b 油菜 R:GGTGGGAGCCAAGAGACTTC 169 bp (cytb)gene P:FAM-TTTTCATTTGGTGCCCTGAAGAAGAAGG-TAMRA 6.2 三氮甲烷（氯仿）。 6.3 异丙醇。 6.4 体积分数为70%的乙醇。 6.5 NaCI溶液(1.2mol/1.)。 6.6 蛋白酶K（20mg/mL）。 2 SN/T4848.2-2017 6.7CTAB提取缓冲液:20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,0.02mol/LNa2EDTA pH 8.0。 6.8CTAB沉淀液：5g/LCTAB,40mmol/LNaCl。 6.910×PCR缓冲液:200mmol/LTris-HCl(pH8.4)，200mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2。 6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U～2U(Unit，酶学单位）的Taq酶、1X PCRbuffer、2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg2+、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A，C,G) TPs、0.2mmol/L0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪无需ROX校正）。 7仪器设备 7.1实时荧光PCR仪。 7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度针。 7.3恒温水浴锅。 7.4 离心机：离心力≥12000g。 7.5 微量移液器：0.5μ~10μ，10μl~100μ，20μl200μl，200μ~1000μ。 7.6 恒温混匀仪。 7.7 涡旋震荡器。 7.8 pH计。 7.9量筒：容量50mL。 烘箱。 7.10 检测步骤 8.11 DNA提取 8.1.1蜂蜜沉淀DNA提取 8.1.1.1 蜂蜜样品50℃水浴20min至充分融化，上下颠倒混匀。 8.1.1.2取20mL蜂蜜样品，分成2管，每管10mL于50ml离心管中，加人无菌双蒸水至30mL，涡 旋混匀，4000r/min离心10min，吸出上清（4℃贮存备用）。 8.1.1.3 沉淀部分用1mL无菌水洗脱，分装于2mL离心管中，12000r/min离心5min去除上清。 8.1.1.4 加人600μLCTAB提取缓冲液，置于65℃恒温混匀仪中温育1h～2h，转速为650r/min； 12000r/min离心10min。 离心10min。 8.1.1.6 加人等体积CTAB沉淀液混匀，13000r/min离心10min。 8.1.1.7 弃上清，加上350μl，1.2mol/INaCI溶液，充分溶液沉淀。 8.1.1.8 加人0.8倍体积的异丙醇混匀，一20℃放置0.5h～1h.12000r/min转速4℃离心10min～ 15 min。 8.1.1.93 弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000r/min转速下4℃离心10min。 8.1.1.10弃上清，室温下晾干。加人50uL～100μL双蒸水，溶解沉淀，一20℃保存。 8.1.2蜂蜜上清DNA提取 将上清分装到2个50mL离心管中，每管20mL，参照附录B步骤进行核酸DNA提取，DNA存放