SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4827—2017 蛙脑膜炎败血金黄杆菌病检疫技术规范 Quarantine protocol for Chryseobacterium meningosepticum of frog 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 O SN/T 4827—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 疫局。 本标准主要起草人：徐淑菲、孔繁德、谢明星、唐泰山、王凯民、姜焱。 1 SN/T 4827—2017 蛙脑膜炎败血金黄杆菌病检疫技术规范 1范围 本标准规定了用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的临床症状及细菌学、PCR等实验室诊断、检测方法。 本标准适用于蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的流行病学调查、监测、诊断和出入境检验检疫 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088出入境动物检疫采样 3试剂和培养基 除另有规定外，以下所用生化试剂均为分析纯。正文中试剂配制方法见附录A。 3.1营养肉汤。 3.2胰蛋白陈大豆琼脂（TSA）。 3.3石 硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂（TCBS）。 3.4 营养琼脂。 3.5 生化鉴定试剂盒。 3.6 革兰氏染色液。 3.7 DNA提取试剂：蛋白酶K、SDS、酚-氯仿抽提法所需要的相关试剂；商品化的DNA提取试剂盒 3.8 PCR试剂：10X浓缩缓冲液、dNTP、氯化镁、6X电泳上样缓冲液、琼脂糖、5X电泳缓冲液（TBE） 等，均为商品化试剂盒中成分。 3.9 引物： a）特异性引物： -P1:5'-GATTCGTCGGATTATATTG-3'; P2:5'-CCACTTCAACCTTACTCAAGACTAAC-3。 浓度为10μmol/L，扩增产物大小为475bp~479bp。 b）通用引物： P3:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3"; -P4:5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3'。 浓度为10μmol/L，扩增产物大小为1488bp。 3.10阴性和阳性对照：由国家质检总局指定实验室提供。 3.11 DNADL2000Marker适合检测分子量大小100bp～2000bp间的DNA片段，一20℃保存。 4疾病概述 蛙脑膜炎败血金黄杆菌病，是由脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabethkingiameningoseptica）引起 SN/T 4827—2017 蛙、鳖等多种水生动物的一种传染病。脑膜炎败血伊丽莎白菌也称脑膜脓毒性金黄杆菌、脑膜炎败血黄 杆菌或脑膜炎败血金黄杆菌。该菌可感染牛蛙、美国青蛙、虎纹蛙、中华鳖和沙鉴等各种养殖蛙类和鉴 类，蛙是主要宿主，也可感染猫、犬、鼠和人。5月～10月为主要的发病季节；室内恒温养殖情况下，发病 季节不明显。 病蛙出现运动机能失调、头部歪斜、身体失去平衡或浮于水面打转等，眼部因感染出现白色坏死（白 内障)症状，同时伴有皮肤溃疡、肝坏死等症状。 取濒死发病蛙内脏或脑部组织，涂片，镜检，可观察到革兰氏阴性、细长、末端略圆突状的杆菌。 5设备和材料 5.1天平。 5.2离心机。 5.3微量移液器。 5.4凝胶成像仪或紫外透射仪。 5.5PCR仪。 5.6恒温培养箱。 5.7冰箱。 5.8显微镜。 6 检测方法 6.1 细菌学检测方法 6.1.1取样 按照GB/T18088的规定采样。取发病蛙眼，脑、肝脏等组织作为样品。 6.1.2操作步骤 6.1.2.1增菌 无菌取待检样品25g，加入营养肉汤225mL，用均质器以8.000r/min～10000r/min均质 1min～2min；或置于盛有225ml.营养肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，于 28℃±1℃培养18h24h。 6.1.2.2分离培养 将上述经过增菌的培养物，用无菌接种环分别划线接种到TSA、TCBS、营养琼脂等平板上，于 28℃±1℃培养18h～24h。典型菌落特征：在TSA上，菌落直径1mm～2mm，圆形突起，有光泽， 呈白色、微黄或亮黄色；在TCBS上，菌落量绿色；在营养琼脂平板上，菌落呈微黄或亮黄色。 脑膜炎败血伊丽莎白菌可在37℃生长.但无明显色系形成。 挑取典型菌落，接种营养肉汤或其他培养基作为纯培养物，用于后续试验 6.1.2.3革兰氏染色镜检 取一干净的载玻片.用接种环挑取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均勾；晾干载玻片；按照说明 书用革兰氏染色试剂（见A.1、A.2)进行染色。显微镜下观察，脑膜炎败血伊丽涉白菌为革兰氏阴性、细 长、末端略圆突的杆菌.大小(0.4um~0.5um）×（0.8um～1.0um）。单个分散排列，无题毛、无芽孢、 2 SN/T 48272017 无英膜、不运动。 6.1.2.4生化试验 6.1.2.4.1氧化酶试验 用无菌接种环或其他无菌工具挑取纯培养物，滴加氧化酶试剂或涂布于氧化酶试纸表面进行氧化 酶试验。如果氧化酶试剂或试纸在规定的范围内变为紫色或深紫色，则为氧化酶阳性。 脑膜炎败血伊丽莎白菌氧化酶试验为阳性。 6.1.2.4.2其他生化试验 可选择商品化的生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行生化试验。 脑膜炎败血伊丽莎白菌生化鉴定结果参见附录B。 6.2PCR方法 6.2.1取样 同5.2.1。为提高检出率，样本可保存于95%的乙醇中，或于冰上冷藏并于24h内送检。或 一80℃低温冰箱长期保存。试验必须设立阴性、阳性和空白对照。 可疑菌接种营养肉汤，提取细菌核酸DNA以待检测。 6.2.2DNA的提取 取15mg~30mg上述样品加到1.5mL离心管中，若是菌液5000r/min离心5min，去除上清液； 若是组织器官用研磨棒充分研磨。加20μL蛋白酶K（见A.3）再加SDS（见A.4)至终浓度为1%，上 下颠倒混勾；混合液置于55℃水浴，水浴2.5h；接着向匀浆液中按1：1比例加酚/氯仿/异戊醇混合液 （25：24：1)（见A.5），轻轻震荡混匀5min，12000g离心5min；吸上层水相800μl.于一灭菌塑料离 心管中，再加人等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min，12.000g离心5min；吸上层水相 500μL于一塑料离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h或液氮中放置5min；12000g 离心5min，沉淀DNA，吸弃上清液；于沉淀中加人75%乙醇溶液500μL轻轻混勾后12000g离心 5min，吸弃上清液，室温挥干；向DNA沉淀中加200μLTE（见A.6)缓冲液，一20℃保存备用。或者 采用等效的商业化的DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。 6.2.3第一次PCR检测 6.2.3.1反应体系 PCR总体积50μL，10×浓缩缓冲液5μL，氯化镁（25mmol/L）4μL，dNTP（10mmol/L）2μL， 6.2.3.2设立对照 在样品处理过程中必须设立阳性样品对照（标准阳性菌株或其他标准的阳性质控作对照）、阴性样 品对照（用核酸裂解液代替模板作为阴性对照）、空白对照（取等体积的水代替模板作为空白对照）。 6.2.3.3 反应条件 将反应混合液混匀后稍离心，按以下反应程序进行扩增：95℃5min，1个循环；然后95℃30s； 50℃30s，72℃1min，25个循环；再72℃5min。 3