SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4826—2017 禽螺旋体病检疫技术规范 Quarantine protocol for Avian Spirochaetosis 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 刮涂握查真伪 SN/T 4826—2017 言 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：刘生峰、杨俊、陆丽华、聂福平、王昱、张雷、李贤良、王国民、李应国。 1 SN/T4826—2017 禽螺旋体病检疫技术规范 1范围 本标准规定了禽螺旋体病的病原分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光PCR和酶联免疫 吸附试验（ELISA)的检测技术。 本标准适用于禽螺旋体病的检疫或流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集，运输和保存规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AS：禽螺旋体病 B.B：伯氏疏螺旋体 BSK-H:BSK-H培养基(Barbour-Stonner-Kelly-Hmedium) ELISA：酶联免疫吸附试验 PBS:磷酸缓冲液 HRP：辣根过氧化物酶 OD值：光密度值 PCR：聚合酶链式反应 BSA：牛血清白蛋白 dNTPs:脱氧核苷酸 SDS十二烷基硫酸钠 4 疫病概述 禽螺旋体病（AvianSpirochaetosis，AS）是由伯氏疏螺旋体（Borreliaburgdorferi）引起的，可致多 种禽类感染的以发热、精神沉郁、厌食和下痢为其特征的急性败血性传染病。伯氏疏螺旋体属于原核生 物界（KingdomMonera）、螺旋体目（Spirochaetidae）、螺旋体科（Spirochaetaceae）、疏螺旋体属 （Borrelia）（也称包柔氏螺旋体属）。禽螺旋体病呈世界性分布，我国农业部和质检总局发布的《进境动 物检疫疫病名录》，将其列入二类进境动物疫病，欧洲发生较多。我国新疆（1983年）曾有发生过鸡螺旋 体病的报道。其流行病学、临床及病理变化参见附录A。 5样本采集 5.1试剂和材料 5.1.1主要试剂：BSK-H培养基（见附录B)、吉姆萨染液、革兰氏染液、生理盐水、甲醇。 1 SN/T4826—2017 5.1.2主要仪器设备和器材：无菌剪刀、镊子、平血、烧杯、玻璃瓶、组织研磨器、注射器、离心机、高压灭 菌锅、冰柜、生物安全柜、生物显微镜等。 5.2病料的采集、保存和运输 病料从发热或发病活禽及滨死禽中采集。对于活禽可用翼静脉采血，分离血清用于抗体的ELISA 检测，用肝素钠为抗凝剂无菌采集抗凝全血用于病原分离试验。对于病、死禽应无菌采集小肠、脾、肝、 肾、心、肺等组织脏器。采样后应立即处理（见6.1），若暂时不能处理，可于一70℃冰柜中保存。样品的 保存和运送按SN/T2123进行操作。 6病原分离与鉴定 6.1组织样品的处理 将组织样品2g，无菌接种至装有7mLBSK-H培养基的10mL具塞试管中，32℃33℃增殖培 养7d后，取菌悬液涂片镜检。血液样品处理；取待凝血经1000r/min离心10min后，取血清及血细 胞交界处淡白色悬液涂片镜检。 6.2病原显微镜检 取6.1的待检悬液数滴到载玻片中央，用接种环将悬液均匀涂布在载玻片上形成液膜，待液膜干燥 后，用甲醇固定2min3min。滴加稀释好吉姆萨染液使全部覆盖玻片，室温染色15min～30min后， 用蒸馏水从玻片一端冲洗，晾干后镜检。也可经革兰氏染色后镜检。 7 PCR 7.1试剂和材料 7.1.1主要试剂：液氮、十二烷基硫酸钠（SDS）、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、PCR反 应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP、琼脂糖、DNAmarker。 7.1.2主要仪器设备和器材：研体、PCR仪、离心机、电流仪、电泳槽、凝胶成像系统、一20℃冰箱。 7.1.3样品及处置：对脏器组织样品取约2g，置入无菌研钵中，加液氮研磨后，取匀浆液200μl置人 管中。对离心管中收集物经12000r/min离心10min后弃上清，收集沉淀用于提取核酸；同时设立伯 氏疏螺旋体标准菌株增养物作为阳性对照；SPF鸡血为阴性对照。 7.2引物和序列 引物和序列如下： P1:5'-CTTCTCAAGGCGGAGTTAA-3'; --P2:5'-CCTCATCTGTCATTGTAGCA-3。 扩增目的片段为225bp。 7.3核酸提取 7.3.1向5.1.3收集的沉淀中，加人500ul抽提缓冲液（100mmol/1，氛化钠，10mmol/LTris-Cl pH8.0，25mmol/LEDTApH8.0.终浓度10g/1.SDS和终浓度0.1g/1.蛋白酶K)悬浮后，55℃水浴 2 SN/T 4826-2017 中反应2h，同时设立伯氏疏螺旋体标准菌株培养物作为阳性对照；SPF鸡血为阴性对照。 12000r/min离心10min，将上层液体转移至另一个1.5mL离心管中，加人1/10体积3mol/L的乙酸 钠和2倍体积无水乙醇，一20℃放置2h（或更长时间）。 7.3.312000r/min离心10min，弃去上清液。加人500μL70%冷乙醇洗涤一次，尽量弃去上清。 7.3.4待离心管中液体自然干燥后，加入50μL双蒸水溶解沉淀，即为DNA模板。 7.3.5 核酸提取可使用等效的商品化细菌核酸提取试剂盒。 7.4J PCR检测 7.4.1 反应体系 10XPCR缓冲液 2.5 μl 10 μmol/L P1(P1) 1 μL 10μmol/LP2(P2) 1 μL dNTPs 2 μL DNA模板 5 μl, TaqDNA聚合酶 0.5 μL 水 13 μL 总体积 25 μL 7.4.2 反应程序 反应程序：95℃5min；94℃30s，55℃45s，72℃1min，共35个循环；72℃延伸10min。 7.5琼脂糖凝胶电泳分析 用1×TBE电泳缓冲液配制2%琼脂糖凝胶平板（见附录B），将平板放人水平电泳槽，使电泳缓冲 液刚好淹没胶面。取8μLPCR产物和2μL样品缓冲液混匀后加入样品孔，同时在凝胶的另一孔加入 DNA分子量标准物质（DNAmarker）。调节电压为约5V/cm电泳约25min。在紫外灯下观察是否出 现大小约为225bp的基因片段。 7.6结果判定 在阴性对照、空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样本未出现 相应大小的扩增条带，则判定该样本的PCR检测结果为阴性；如待测样本出现预期大小扩增条带则应 测序验证，参考序列参见附录C。 8实时荧光PCR 8.1试剂和材料 8.1.1主要试剂：液氮、十二烷基硫酸钠（SDS）、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、PCR反 应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs。 8.1.2主要仪器设备和器材：研钵、荧光PCR仪、离心机、一20℃冰箱。 8.1.3样品及处置：对脏器组织样品取约2g，置无菌研钵中，加液氮研磨后，取匀浆液200μL置人 1.5mL离心管中；对6.1中增菌悬液取200μL～500μL置入1.5ml离心管中；对血液样品，取待凝血 经1000r/min离心10min后，取血清及血细胞交界处淡白色悬液200μL~500μL置人1.5mL离心