SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4825—2017 牛羊肝片吸虫病检疫技术规范 Quarantine protocol forFasciolosis in bovine and sheep 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 KOX 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 牛羊肝片吸虫病检疫技术规范 SN/T 4825-2017 中国标准出版社出版 北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029） 北京市西城区三里河北街16号（100045） 总编室：（010)68533533 网J:www.spc.net.cn 中国标准出版社奈皇岛印刷广印刷 * 开本880×12301/16印张1字数26千字 2018年7月第一版2018年7月第一次印刷 印数1-500 书号：155066·2-33310 定价21.00元 SN/T 4825—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴绍强、王彩霞、赵治国、王海艳、吕继洲、林祥梅、赵林立、邓俊花、梅琳、崔强、 敖威华、张晓东、陈宇飞。 SN/T4825—2017 牛羊肝片吸虫病检疫技术规范 1范围 测等技术规范。 本标准适用于牛羊等活动物肝片吸虫感染情况检测、牛羊肝脏等动物产品中肝片吸虫的检疫，也适 用于牛羊养殖场肝片吸虫病的流行病学调查和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 3疫病概述 参见附录A。 4材料 4.1 除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求。 4.2 饱和盐水溶液：配制方法见B.1。 4.3 福尔马林溶液：配制方法见B.2。 4.4 酸乙醇：配制方法见B.3。 4.5 德氏苏木素染液：配制方法见B.4。 4.6 荧光PCR反应液2XPreMix为商品化试剂盒中成分。 4.7 肝片吸虫抗体检测试剂盒：本标准以IDEXX公司生产的FasciolahepaticaAntibodyTestKit"为 例进行操作，也可采用经过验证、检测效果确实的其他肝片吸虫ELISA检测试剂盒。 4.8引物和探针：FasITS-F：5-ACCCTTGTCTTGGCAGAAAGC-3；FasITS-R：5"-CAAACA- CACT-ECLIPSE-3'。引物和探针合成后均采用灭菌ddHzO稀释为10μmol/L，扩增片段长度为89bp （具体序列参见附录C）。 9荧光PCR检测阴阳性对照：阳性对照为已知肝片吸虫样品；阴性对照为健康牛（羊）肝组织样品。 4.9 5 5仪器设备与耗材 5.1显微镜。 1）FasciolahepaticaAntibodyTestKit是适合的市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并 不表示对这一产吕的认可。 1 SN/T4825—2017 动物解剖台。 5.2 5.3载玻片。 5.4恒温培养箱、振荡器。 5.5酶联免疫检测仪、超净台。 5.6 实时荧光PCR仪。 5.7 一80℃超低温冰箱、一20℃冰箱、4℃冰箱。 5.8 高速冷冻离心机。 高压灭菌锅。 5.10 水浴锅。 5.11 制冰机。 5.12 吸管、微量移液器及配套的吸头。 6检测方法 6.1病原形态学检查 6.1.1粪便检查 符合GB/T18088。 采取粪便样品10g，置于烧杯内注人100mL密度为1.18g/cm的饱和盐水，用玻璃棒搅拌至均 匀的混悬液，静置15min20min。用小铲除去浮于表面的粪渣。用吸管吸弃上清液。大量检查样品 时，可将浮渣及上清液小心倒出，在杯底剩余20ml~30mL沉渣向沉渣中加水至满杯，仔细用玻璃 棒搅拌至混悬液。使用网眼直径为0.25mm的金属筛过滤混悬液，并使滤液静置5min，吸弃上清液， 再用少量水洗涤烧杯，静置3min～5min，然后吸弃上清液，如此反复操作3～5次，最后用吸管将沉渣 移于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜10倍物镜下循序镜检 6.1.2剖检 按照常规的动物户体剖检操作步骤（见附录D）对死亡动物进行剖检。急性型可见幼虫移行时引起 的肠壁、肝组织和其他器官的组织损伤和出血，腹腔和“虫道”内可发现童虫。慢性型肝脏肿大，胆管呈 绳索样凸出于肝表面，胆管壁发炎，粗糙，有磷酸盐沉淀肝实质变硬。切开后在胆管内可见成虫，形似 木耳状成虫钻出，伸展开后形似柳叶状，呈红棕色。有时亦在胆囊中。将虫体按照附录E中的操作步 骤采集后并制成虫体压片，置显微镜下观察虫体形态。 6.1.3形态特征 6.1.3.1虫卵形态 虫卵椭形.淡黄祸色，133um～190um×7um～91um，卵的一端有小盖，卵内充满卵黄细胞和1 个胚细胞（参见F.1）。 6.1.3.2成虫形态 虫体长为20mm～75mm.宽5mm～14mm。体表有细棘前端突出略似圆锥、叫头锥。口吸盘在业 体的最前端.在头锥之后股腹面具腹吸盘。生殖孔在腹吸盘的前面。口吸盘的底部为口、口经职通向食道和 肠.肠管分枝而且外侧枝较多。雕雄同体.有精巢2个，前后排列星树枝状分支.卵巢一个星鹿角状分支. 在前精巢的右上方，在案丸前的业体中央有卵模1个，在卵模与股吸盘之间为山折重叠的子管，内充满虫 卵。卵黄腺有许多祸色颗粒组成.分布于虫体两侧。体后端中央有纵行的排泄管（参见F.2）。 2 SN/T4825—2017 6.2ELISA检测 6.2.1试剂准备 6.2.1.1 洗液稀释 浓缩洗液（20×）在冷藏保存时可能析出盐，用前必须恢复至室温并摇匀使析出的盐溶解，然后采用 蒸馏水进行1：20稀释为工作液，工作液需在2℃～8℃保存，3天内可稳定使用。 6.2.1.2酶标抗体稀释 酶标抗体浓缩液（100X）在使用前必须用随盒提供的1号稀释缓冲液（DilutionBufferNo.1）进行 1：100稀释。18℃26℃条件下，稀释好的酶标抗体，可在8h内使用。 6.2.2血清稀释及加样 取190μL随盒提供的2号稀释缓冲液（DilutionBufferNo.2)加人到每个微量反应孔。 在1个未经抗原包被的孔（奇数列）和1个对应的经抗原包被的孔（偶数列）各加人10μL未经稀释 的阴性对照； 在2个未经抗原包被的孔（奇数列）和2个对应的经抗原包被的孔（偶数列）各加人10μL未经稀释 的阳性对照； 在剩余的未经抗原包被的孔（奇数列）和对应的经抗原包被的孔（偶数列）各加人10μL未经稀释的 样品。 表1ELISA反应板使用样式表 5 6 7 10 11 12 d A 阴性对照 样品6 样品14 样品22 B 阳性对照 样品7 样品15 样品23 c 阳性对照 样品8 样品16 样品24 样品32 样品40 D 样品1 样品9 样品17 样品25 样品41 E 样品2 样品10 样品18 样品26 样品42 F 样品11 样品19 样品27 样品35 样品43 样品4 样品12 样品20 样品28 G 样品36 样品44 样品45 H 样品5 样品13 样品21 样品29 样品37 6.2.3孵育 用振荡器振荡混匀后，用膜封口，37℃孵育1h。 6.2.4洗涤 弃去孔中液体，用洗涤液洗涤ELISA反应板3次。 6.2.5酶标抗体 每孔加人100μL稀释好的酶标抗体。用封口膜密封微量反应板，37℃孵育30min。 3