SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4821—2017 牛脊椎畸形综合征TaqMan探针PCR 检测方法 Detectionmethodforbovinecomplexvertebral malformationbyTaqManPCR 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4821—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局、中华人民 共和国厦门出人境检验检疫局 本标准主要起草人：吴晓薇、刘中勇、贾广乐、彭小莉、陈茹、朱道中、鱼海琼、刘志玲、段燕瑜、 林志雄。 SN/T4821—2017 牛脊椎畸形综合征TaqMan探针PCR 检测方法 1范围 本标准规定了牛脊椎畸形综合征（参见附录A)TaqMan探针PCR的检测方法。 本标准适用于快速筛查牛群中隐性牛脊椎畸形综合征基因携带者。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件： CVM脊椎畸形综合征（ComplexVertebralMalformation） TaqMan探针TaqMan探针（TaqManprobes） PCR聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction） Ct值荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（Cyclethreshold) SNP单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism） 4原理 TaqMan法的SNP分型检测技术的原理：在普通聚合酶链反应的基础上时，加入一对两端有不同 荧光标记的特异性探针来识别不同的等位基因（allelel和allele2）。5端为报告荧光基团（reporter）， 3'端为淬灭荧光基团（quencher)。两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异性退火结 合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光；当特异的探针与相应的 等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5'到3'外切酶活性，荧光报告基团被切割下来，脱离了3'端淬灭荧 光基团的淬灭作用（quench）从而发出荧光信号。根据检测到荧光信号的不同，可以判断相应样本的 SNP等位基因型。 仪器设备和试剂耗材 5.1 仪器与设备 荧光定量PCR仪。 恒温水浴锅。 台式冷冻离心机（转速可达到12000r/min）。 SN/T4821—2017 漩涡混匀器。 微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL)及配套吸嘴。 Ⅱ级生物安全柜。 5.2试剂与耗材 5.2.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分 析纯。 5.2.2 DEPC水：按照附录B制备，推荐使用商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。 5.2.3 饱和酚和异丙醇：分析纯，使用前预冷至 5.2.4 酚：三氯甲烷：异戊醇混合液：配制方法见附录B。 5.2.5 75%乙醇：配制方法见附录B。 5.2.6 荧光PCR试剂盒。 5.2.7 10%SDS：配制方法见附录B。 5.2.8 阳性对照为采集阳性牛的血液样品，阴性对照为采集阴性牛的血液样品，均保存于一20℃备用。 6 5引物与探针序列 上游引物（CVM-F)5-AGCTGGTCACAATTTGTAGGT-3 扩增序列参见附录C PROBE1:5'VIC:TCATGGCAGTTCTCA-BHQ PROBE2:5' FAM:TCATGGCAT CA-BHQ-3 采用DEPC水将每条引物和探针配制成100 μmal/L储存液 -20℃或更低温度冻存；使用时取 适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻 7样品采集、保存及运输 采集牛的抗凝血，冷藏储存与运输 8DNA提取 8.1将血液样品200μL，加人2mL塑料离心管中，加20μL蛋白酶K，再加10%SDS20μL，混匀。 8.2混合液置于55℃水浴2.5h。 8.3向匀浆液中按1：1比例加酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1)，轻轻震荡5min后12000r/min 离心5min。 8.4吸上层水相400μL于一灭菌塑料离心管中，再次加人等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻震 荡混匀5min，12000r/min离心5min。 8.5吸上层水相500μL于一塑料离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h；12000r/min 离心5min，倾去上清液。 8.6向DNA沉淀中加人75%乙醇溶液500μL，轻轻混匀后12000r/min离心5min，倾去上清液，室 温凉干。 8.7向DNA沉淀中加70μLTE缓冲液，溶解沉淀一20℃保存备用。 2 SN/T4821—2017 注：DNA提取也可以采用等效组织DNA提取试剂盒，按照说明书进行。 9TaqMan探针PCR检测 9.1设立对照 从样品处理开始，应设置对照 以CVM的野生型（G/G型）的DNA作野生型对照；以杂合型（G/T型）的DNA作杂合型对照；以 突变型（T/T型）的DNA为纯合型对照；以灭菌双蒸水作阴性对照。 9.2Taqman探针PCR的反应体系（25μL） 反应体系：体积为25μL，包括实时荧光PCR反应混合液12.5μL（DNA 聚合酶1U～2U,荧光 PCR缓冲液，Mg2SO,2.5mmol/L~4.0m mol/L.dNTP0.25mmol/L.ROX 染料0.4mmol/L），一对 引物各1μL，一对探针各1μL，DNA模板2μL,加双蒸水补至25μL。 9.3荧光PCR反应 荧光素设定：ReportDye设置为FAM和VIC.Quenc ye都设定为BHQ，ReferenceDye设定为 None。 第一阶段，预变性94℃3min； 第二阶段，扩增94℃30s，60℃ 30s72℃30S.40个循环 Ct值判定结果。 9.4结果判定 9.4.1 质控对照判定 选择FAM和VIC通道进行结果分 野生型（G/G型）对照样品：出现 条扩增曲线，为FAM的典型扩增曲线：Ct值小于30。 突变型（T/T型）对照样品：出现 VIC的典型护增曲线： Ct值小于30。 杂合型（G/T型）对照样品：出现两条 典型扩增曲线，为FAM和VIC的# 扩增曲线。Ct值小于30。 L附录D，牛脊椎畸形综合征的TaqMan探针 空白对照：应无曲线出现，Ct值显示为 None。（参见 PCR检测参考图谱）。 质控对照不出现上述结果视为本次实验无效。 9.4.2样品结果判定 在质控有效的条件下进行结果判定。 检测样品出现一条FAM探针扩增曲线，且Ct值≤30，则样品判定为CVM野生型（G/G型）阳性 检测样品出现一条VIC探针扩增曲线，且Ct值30，则样品判定为CVM突变型（T/T型）阳性。 检测样品FAM和VIC两个探针扩增曲线，且Ct值30，则样品判定为CVM的杂合型（G/T型）阳性。 若待检样品出现特征性扩增出上述任一条曲线Ct值介于30和35之间时，应重新进行实时荧光 PCR检测。若则重新检测的Ct值仍介于30和35之间，则可以根据扩增出的曲线对照质控参考图谱 判断阳性类型。若重新检测的结果中Ct值≥35时，无法判断实验结果。可以选择其他检测方法，或重 新采集该牛的血液样品进行检测。 3 SN/T 4821—2017 附录A （资料性附录） 牛脊椎畸形综合症概述 牛脊椎畸形综合征（ComplexVertebralMalformation，简称CVM），由丹麦科学家Agerholm于 1999年最早报道。CVM的遗传学基础是牛3号染色体上编码尿苷二磷酸-氮-乙酰氨基葡萄糖转运蛋 白（UDP-N-acetylglucosaminetransporter）的SLC35A3基因第4外显子第559位点碱基发生G/T突 变（G559T)，该突变使蛋白的第180位氨基酸由缬氨酸变为苯丙氨酸（Val-→Phe)，从而影响尿苷二磷 酸-氮-乙酰氨基葡萄糖从细胞质中转运到高尔基体中，导致发病。 CVM的临床症状：CVM是一种较严重的奶牛隐性遗传疾病，CVM隐性遗传缺陷基因纯合时可以 造成妊娠早期流产、死胎或特牛出生后很快死亡，患畜最显著的特征为脊椎弯曲畸形（脊椎弓背）、两前 腿筋腱缩短、腿部畸形、系部呈现对称的向内僵直、颈短和心脏畸形等综合症状。其中50%的案例伴有 心脏病变，有些患畜还存在肺部畸形。 CVM携带者表现正常，并无发病现象。CVM的传播符合孟德尔分离与自由组合遗传规律（Liew M，2004），即携带CVM基因的杂合子个体表现正常，而携带杂合子的双亲杂交的后代会有75%的特牛 个体表现正常，25%的特牛为隐性纯合，这些纯合个体均会发生流产死亡。 CVM造成的患病胎儿只有极少数在出生时还能存活，有数据显示，母牛妊娠56天时，CVM纯合 子胎儿的死亡率是16%：妊娠150天时，死亡率上升到45%；妊娠260天时，77%的患儿已经死亡，而能 够完成整个妊娠期的胎儿仅占7%。 CVM野生型（G/G型）：正常牛基因型。 CVM突变型（T/T型）：CVM基因携带者杂合子。 CVM杂合型（G/T型）；CVM基因携带者纯合子。 SN/T4821—20