SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4818—2017 进出口食用动物中莱克多巴胺、 沙丁胺醇、盐酸克伦特罗的测定 酶联免疫吸附法 Determinationof ractopamine,salbutamol,clenbuterolhydrochloride in edible animalforimported and export--Enzymelinked immunosorbent assaymethod 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4818—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：孙明君、孙涛、梁广辉、梁成珠、郑小龙、岳志芹、朱来华、徐彪。 I SN/T4818—2017 进出口食用动物中莱克多巴胺 沙丁胺醇、盐酸克伦特罗的测定 酶联免疫吸附法 1范围 本标准规定了进出口食用动物的血浆、尿液中莱克多巴胺、沙丁胺醇和盐酸克伦特罗残留检测的酶 联免疫吸附测定方法。 本标准适用于进出口禽类的血液、畜类的血液及尿液中莱克多巴胺、沙丁胺醇和盐酸克伦特罗残留 量快速筛选检测，适用于出入境检验检疫工作。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 利用抗原抗体特异性结合的特性和酶的高效催化作用，通过化学方法将辣根过氧化物酶（HRP)与 克伦特罗（CL）偶联，形成辣根过氧化物酶标记克伦特罗。将固相载体上已包被的抗体与特异性的抗克 伦特罗抗体结合，使抗克伦特罗抗体固相化，然后加入待测克伦特罗和辣根过氧化物酶标记克伦特罗， 待测克伦特罗多，则被结合的酶标记克伦特罗少，显色剂颜色浅，反之则深。用目测法或比色法测定样 品中的克伦特罗含量，比色的最佳波长为450nm。 沙丁胺醇与莱克多巴胺原理同克伦特罗 4试剂与材料 4.1 1mol/L氢氧化钠：配制参见附录A，试验用水应符合GB/T6682要求。 4.2 乙酸乙酯：分析纯。 4.3 β-葡萄糖醛酸苷酶：含β-葡萄糖醛酸苷酶111000U/mL。 4.4 磷酸钾缓冲液。 4.5 硼酸盐缓冲液。 4.6 包被缓冲液。 4.7 洗涤缓冲液。 4.8 封闭缓冲液。 4.9 稀释缓冲液。 4.10 辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液。 1 SN/T4818—2017 4.11 底物液。 4.12 显色剂液。 4.13 终止液。 4.14 抗抗体（克伦特罗为羊抗鼠IgG，沙丁胺醇、莱克多巴胺为免抗绵羊IgG）。 4.15 5抗体（克伦特罗为鼠源单抗、沙丁胺醇和莱克多巴胺均为绵羊源多抗，抗体效价应>5000或有效 抗体含量应>5mg/mL、ICso<1.0）。 4.16HRP偶联物（克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺3种，交联比为（6～12）：1，以偶联物浓溶液保 存，使用前需用辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液稀释）。 4.17包被IgG抗体的聚苯乙烯微量96孔反应板。 4.18标准品：莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗（英文名称分别为：Ractopaminehydrochloride、 Salbutamolsulfate,Clenbuterolhydrochloride),纯度≥99%。 4.19标准品贮备液：准确称取标准品（折合成目标化合物10.0mg），用适量甲醇溶解，并用甲醇定容至 10mL，混匀。一18℃以下避光保存，有效期为12个月。 4.20标准品中间液：用甲醇稀释标准储备液至10mg/L，4℃以下避光保存，有效期为6个月。 4.21标准品工作液：用稀释缓冲液稀释标准中间液至工作浓度0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7ug/L、 8.1μg/L，现用现配。 5 仪器和设备 5.1 分析天平：感量0.0001g。 5.2 酶标仪，带有450nm滤光片。 5.3 离心机：转数≥8000r/min。 5.4 超声波发生器。 5.5 微量移液器：单道20μL、50μL、100μL和多道50μL~350μL。 5.6 15mL离心管。 5.7 酸度计：pH测量范围0~14。 5.8 涡旋式混合器。 5.9 旋转蒸发仪。 5.10 振荡器。 6测定步骤 6.1 试样制备和保存 6.1.1试样制备 分别取食用活动物的血液100mL放于抗凝血试管中、新鲜尿液样品约50mL，将样品分成两等 份，装人洁净容器内，作为试样密封并标明标记。 6.1.2 试样保存 所采集食用动物的尿液、血浆置于4℃下保存备用，可保存3天～4天。若长期保存需将试样于一18.℃ 以下冷冻保存，在制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2提取 取0.5mL样品于15mL螺纹离心管中，加入3mL磷酸钾缓冲液稀释。然后加入10μLβ-葡萄糖 2 SN/T4818-2017 醛酸酶，在37℃条件下水解2h（或者在室温下过夜）。再加人2mL硼酸盐缓冲液，并用1mol/L NaOH调节pH至8～9。用3mL乙酸乙酯漩涡振荡萃取。室温（20℃～25℃）下，4000g离心 10min。取上清液于新离心管中，60℃蒸干。干燥残留物溶于0.5mLPBS缓冲液。每孔取50μL备 用检测。 6.3 酶联免疫测定 6.3.1 根据待测样品数量和标准样品（每个样品2个平行），决定微孔的使用量。 6.3.2每孔100μL抗体包被板4℃过夜。 6.3.3将微孔内液体垂直倒掉，加入250μL洗涤缓冲液，轻轻晃动后垂直倒掉，再重复洗涤微孔3次， 在滤纸上用力垂直磕掉残留在壁上的液体。 6.3.4每孔加250μL2%牛血清白蛋白.37℃封闭2h。 6.3.5 重复6.3.3操作。 6.3.6 每个微孔中加人100μL的抗体，小心混合后在室温（20℃～25℃）下孵育15min。 6.3.7 重复6.3.3操作。 6.3.8 每个徽孔加人50μL标准溶液或待测样品溶液，然后加人100μL辣根酶标记物，小心地充分混 合，室温（20℃～25℃）下孵育30min。 6.3.9 重复6.3.3操作。 6.3.10 每个微孔加人50μL底物液和50μl显色剂液，充分混合后在室温（20℃～25℃）下暗处孵育 15 min。 6.3.11每个微孔加人100μL终止液，充分混合后30min内于450nm处测量吸光度值。 6.4 空白试验 除不加试样外，均按6.3测定步骤进行。 6.5 质控试验 每次测定均应做一个用空白样品添加药物混合标样的质控样品，添加浓度应为相应产品的检测 低限。 7结果计算 7.1标准曲线的绘制 将6个浓度的标准溶液（0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L）和待测溶液按 限量法测定步骤测定得相应的吸光度值。以0浓度的吸光度BO值为分母，其他标准浓度的吸光度B 值为分子的比值，再乘以100，获得吸光度的百分比。以此吸光度百分比为纵坐标，对应的5个标准浓 度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。该定标模型在0.1μg/L～10μg/L范围内是线性的。 7.2 百分吸光度值的计算 按式（1)计算百分吸光度值： B样品 ×100% 百分吸光度值= (1) B。 式中： B品— 样品孔的平均吸光度值； B。 零标准的平均吸光度值。 3 SN/T4818—2017 7.3 待测溶液中目标物含量的计算 将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上得到相应的药物浓度c（μg/L)，按式（2)计 算血浆和尿液中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇药物的残留量。 X=cXf ·( 2 ) 式中： X-—试样中药物残留量，单位为微克每升(μg/L)； 一从标准曲线中得到的试样中药物含量，单位为微克每升（μg/L)； f试样稀释倍数。 计算结果保留三位有效数字。阳性结果需要经过LC-MS/MS方法进行确认。 8方法性能指标 8.1 灵敏度 本方法在检测猪、牛、羊的血浆和尿液样本中检测低限为0.1μg/L。 本方法在检测猪、牛、羊的血浆和尿液样本中定量限为0.3μg/L。 8.2回收率 本方法在0.1μg/L～10μg/L添加浓度水平上的回收率均为90%土15%。 8.3精密度 对于定量分析，每个试样最少应取两份平行样进行分析。在重复性条件下获得的两次独立测定结 果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。 SN/T4818—2017 附录A （资料性附录） 酶联免疫检测试剂配制 A.11mol/L氢氧化钠：称取40.00g氢氧化钠，用1L容量瓶加水溶解定容。 A.275mmol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8)：缓冲液A：10.2gKHzPO加人蒸馏水至1000mL；缓冲液 B：13.06gKzHPO加人蒸馏水至1000mL，通过缓和缓冲液A和B(按比例1：1)，调节pH至6.8。 A.3 25mmol/L硼酸缓冲液（pH9.0）：9.5g10水硼酸二钠（NazB.O，·10HzO）加人蒸馏水 至1000mL。 A.40.05mol/L碳酸盐包被缓冲液（pH9.6）：称取NaHCOa1.46g、Na2CO：0.97g，加水定容至 500mL，溶解后置于4℃冰箱保存。 A.5 5洗涤缓冲液：含0.01mol/L~0.05mol/LpH7.