SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4810—2017 进出口食用动物β-内酰胺类药物 残留量的测定 放射受体分析法 Determination of β-lactams residues of live animals for import and export- Radio-receptor assay method 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 0 SN/T4810—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局 本标准主要起草人：孟日增、康明芹、宋屿竹、刘韬、刘金华、张旭光、曲辉、王嘉祺、石建平。 I SN/T4810—2017 进出口食用动物β-内酰胺类药物 残留量的测定放射受体分析法 1范围 本标准规定了进出口食用动物血液和尿液中β-内酰胺类抗生素残留的检测方法。 本标准适用于进出口食用活动物中β-内酰胺类6种抗生素（青霉素G、阿莫西林、氨苄青霉素、头孢 霉素、头孢噻呋、邻氯氮青霉素）残留量的筛选检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 本方法的测定原理是药物功能团与微生物受体位点的结合反应，这些位点与某一类种抗生素的共 有功能团相关，应用受体的这种特异性可以实现对某一类抗生素的多残留分析。当样品中含有β-内酰 胺类抗生素时，样品中的β-内酰胺类抗生素残留物与受体试剂中相应受体的结合位点结合，从而阻止了 [1C]标记的青霉素G与受体试剂位点结合。样品中β-内酰胺类药物含量越高，竞争的结合位点越多， ［"C]标记的青霉素G结合的则越少，用液体闪烁计数仪测定样品中["C]含量的cpm值（countper- minute，即每分钟脉冲数)越低。样品中β-内酰胺类抗生素残留量与cpm值成反比。 4试剂和材料 4.1F β-内酰胺类抗生素Charm-IⅡI测定试剂盒"（MRLSequentialAssay）：药片标识为P。 4.21 阴性对照样品：经证实不含β-内酰胺类抗生素的基质浓缩干粉，贮存2℃～6℃。 4.3MSU多抗生素浓缩标准品：含有青霉素G、阿莫西林、氨青霉素、头孢素、头孢噻呋、邻氯青霉 素等多种抗生素的标准品。使用时用10mL水溶解，充分摇匀，配成MSU多种抗生素标准溶液（其中 青霉索G浓度为1000μg/kg）。 4.4MSU萃取缓冲液浓缩干粉：使用时用1000mL水溶解，可于2℃～6℃贮存2个月。 4.5M2缓冲液浓缩干粉：使用时取浓缩干粉用50mL水溶解，配制成M2缓冲液，可于2℃～6℃贮 存2个月。 4.6闪烁液。 4.7 硅硼酸盐玻璃试管及试管塞。 4.8 3具塞塑料离心管：50ml。 1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有 不同，须经实验评估后采用。 1 SN/T4810—2017 4.9水：符合GB/T6682二级水的规定。 5仪器和设备 5.1 液体闪烁计数仪：CharmⅡ7600分析仪。 5.2分析天平：感量为0.1g和0.1mg。 5.3组织匀浆器 5.4离心机：转速可达到2000g。 5.5 涡旋混合器：可振荡与加热。 5.6 微量移液器：20μL100μl，200μL1000μL、1000μL5000μL。 5.7 恒温加热器：65℃±2℃，35℃±1℃。 6分析步骤 6.1 试样制备与保存 6.1.1试样制备 6.1.1.1 尿液：新鲜澄清尿液可直接使用，若混浊应离心去除沉淀物，取上清。 6.1.1.2血液：全血凝固后取血清。 6.1.2 试样保存 试样可于一18℃以下保存，新鲜样品可在2℃～6℃贮存24h。 6.2检测方法 6.2.1对照液的配制 6.2.1.1 阴性对照液的配制：取2mL阴性组织液，加人6mL-MSU萃取缓冲溶液中混匀，制成阴性对 照液，该对照液可在室温下保存6h。 6.2.1.2阳性对照液的配制：取0.3mLMSU多种抗生素标准溶液，加人6mL阴性组织液中混匀，然 后从中取2mL混合溶液加人到2mLMSU萃取缓冲溶液中混匀，制成25μg/kg阳性对照液，该对照 液可在室温下保存6h。 6.2.2试样提取 6.2.2.1取50ml清洁离心管，并标明标记。 6.2.2.2移取2.0mL尿液或者血清样品添加到50mL离心管内，加人30mLMSU萃取缓冲溶液到离 心管，涡旋振荡5min。 6.2.2.3置80℃±2℃孵育器内孵育30min后置冰水内10min。 6.2.2.4于1750g离心10min后，吸出上清液恢复室温，用pH试纸条检查pH是否为7.5，如不准确 则用M2缓冲液或0.1mol/L盐酸调整至pH7.5，即为样品测试液。 注：调节pH值所用溶液的体积应尽量小，以使对浓度的影响可以忽略不计。 6.2.3测定 6.2.3.1从试剂盒中取出试剂片，用试剂盒中所附压杆平端将受体药片推出到洁净试管中，用移液器取 300μL水至样品试管中，用涡旋混合器混合10s将药片打碎。 2 SN/T4810—2017 吸头。 6.2.3.3 用涡旋混合器振荡10s，上下来回10次（以上两步需在40s内完成），将试管置于55℃土1℃ 孵育2min。 6.2.3.4从孵育器上取下试管用药片压杆[1C]标记的青霉素G片剂，涡旋混合10s，上下来回颠倒 10次，将试管置于55℃±1℃孵育2min。 6.2.3.5取出试管，于1750g离心3min，离心停止后立即取出试管倒掉上清液，保持试管口向下倾斜 用吸水材料清除试管内的颗粒物并吸干管壁内的残渍，不要接触沉淀物。 6.2.3.6加300μL蒸馏水到试管内，振荡并混合均匀后加人3mL闪烁液到试管内，将试管塞盖上后， 涡旋混匀至试管内没有不均一的云状物，放入液体闪烁计数仪内，读["C]项的cpm值。 6.2.4控制点的确定 6.2.4.1控制点是判断样品阴性与初筛阳性的一个界定值，可根据筛选水平自行设定。对于同一批号 的试剂，正常情况下只需测定一次控制点。 6.2.4.2筛选水平为25μg/kg时，控制点设定步骤为量取确证为阴性的尿液血清6.0mL样品，加人 0.3mLMSU多种抗生素标准溶液，充分混匀吸取4mL，再加人4mLMSU缓冲液制成标准样品。测 定6个非重复的加标样品的cpm值，求出cpm平均值乘上系数1.2，即为筛选水平25μg/kg的控制点。 7结果判定 7.1当样品的cpm值大于控制点时，判定为“阴性”。 7.2当样品的cpm值小于或等于控制点时，应重新测定样品，且同时需要测定阴性对照液和阳性对照 液。当重新测定样品的cpm值大于控制点时，判定为“阴性”；小于或等于控制点时，则判定为“初 筛阳性”。 8检测限 β-内酰胺类6种抗生素检测限见表1。 表1β-内酰胺类6种抗生素检测限 检测限 检测物 Iμg/ kg 青霖素G 25 阿莫西林 50 氨芋西林 50 邻氣青霖素 300 双氣青霖素 200 头饱噻呋 150