中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4783—2017 出口食品中低聚三果糖、低聚四果糖、 低聚五果糖的测定高效液相色谱法 Determination of kestose,nistose and fructofuranosylnystose in export food- Highperformanceliquidchromatographymethod 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4783—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草， 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、国际检验检疫标准与技术法规研究中 心、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、华南农业大学。 本标准主要起草人：韦晓群、郑璇、宋志刚、娄婷婷、杜斯航、吴志航、张玉文、黄维龙、陈文锐、刘青、 易蓉、王志元、梁瑞婷、卢珍珠。 I SN/T4783—2017 出口食品中低聚三果糖、低聚四果糖 低聚五果糖的测定 高效液相色谱法 1 3种低聚果糖的测 定方 测定。 2 的版本适用于本文 件。 3 再用β-半乳糖酶处 理去 4证 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 柠檬酸（CHO,），分析纯。 4.6低聚果糖标准品：蔗果三糖（C1H32O16，CASNo.：470-69-9），蔗果四糖（C2H42O21，CASNo.： 13133-07-8），蔗果五糖（C3oHs2O26，CASNo.：59432-60-9)3种标准品，纯度≥99%。 4.7蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖混合标准储备液溶液：分别称取蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的标 准品2.5g，一起用水溶解并定容于50mL容量瓶，配成浓度分别为50000mg/mL的蔗果三糖、蔗果四 糖、蔗果五糖混合标准溶液，2℃～4℃保存，有效期为3个月。 5.0mL，用水定容到25mL，配成浓度分别为10000mg/mL的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖混合标准 溶液。 4.9蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准混合工作溶液：分别移取10000mg/mL蔗果三糖、四糖、五糖 标准中间溶液（4.8）5mL、2.5mL、1mL、0.5mL、0.1mL，用纯水定容至10mL配成5000mg/mL、 2500mg/mL、1000mg/mL、500mg/mL、100mg/mL的标准工作溶液，4℃保存，可使用3个月 4.10 pH为5.0的1mol/L磷酸氢二钠缓冲液：先称取1.92g柠檬酸溶解于10mL纯水中，制得 1 SN/T4783—2017 1mol/L的柠檬酸溶液10mL；称取0.71g磷酸氢二钠溶解与48mL纯水中，然后应用1mol/L的柠檬 酸溶液调节磷酸氢二钠溶液pH至5.0，最后定容至50mL。 4.1120U/mLβ-半乳糖苷酶溶液：称取103U/mg的β-半乳糖苷酶固体2mg，溶解在10.3mL的缓 冲溶液（4.10）中，2℃～4℃保存，可使用1个月。 5仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪，配蒸发光散射检测器和柱恒温系统。 5.2 流动相真空抽滤脱气装置及0.2μm或0.45μm微孔膜。 5.3 色谱柱：改性酰胺柱或者氨基柱，5μm，250mmX4.6mm（内径）或性能类似的分析柱。 5.4 分析天平：感量为0.01mg和0.001g各一台。 5.5 离心机：转速>10000r/min。 5.6 涡旋混合器。 5.7 旋转蒸发器。 5.8 恒温振荡水槽。 6测定步骤 6.1提取 6.1.1 纯奶粉样品 称取0.25g样品于50mL离心管中，加人4.73mL水，加人0.07mL醋酸溶液调节pH至4~5之 间，溶解振荡5min，10000r/min离心5min，用定量滤纸过滤，加人0.2mL半乳糖苷酶，于45℃下 （是在恒温振荡水槽中）酶解3h，酶解后取1mL过0.22μm滤膜于进样瓶中，供上机分析。 6.1.2 纯淀粉食品 称取0.25g样品于50mL离心管中，加人4.73mL水，加人0.07mL醋酸溶液调节pH至4~5之 间，然后加人20mL甲醇，振荡5min静置5min，用定量滤纸过滤，旋干滤液后，用水定容至4.8mL，加 入0.2mL半乳糖苷酶，于45℃下（是在恒温振荡水槽中）酶解3h，酶解后取1mL过0.22um滤膜于 进样瓶中，供上机分析。 6.1.3 含奶粉和淀粉食品 称取0.25g样品于50mL离心管中，加人4.93mL水，加0.07mL醋酸溶液调节pH至4~5之 间，然后加人20mL甲醇，振荡5min后10000r/min，用定量滤纸过滤，滤液旋蒸至于，用水定容至 4.8mL，加入0.2mL半乳糖苷酶，于45℃下（是在恒温振荡水槽中）酶解3h，酶解后取1mL过0.22um 滤膜于进样瓶中，供上机分析。 6.2测定 6.2.1液相色谱参考条件 由于测试结果取决于所用仪器，因此不可能给出色谱分析的普遍参数。采用下列参数已被证明对 测试是合适的： a) 色谱柱：酰胺柱或者氨基柱，5μm，250mm×4.6mm（内径）或性能类似的分析柱。 b）柱温：30℃。 2 SN/T4783—2017 c) 流动相梯度见表1。 表1 流动相梯度 时间/min 流动相A：水/% 流动相B：乙睛/% 0 20 80 18 41 59 18.1 80 20 23 80 20 23.1 20 80 30 20 80 (P 流速：1.0mL/min。 进样量：10μL。 e) 6.2.2 检测仪器 蒸发光检测器。 6.2.3 液相色谱测定 在仪器最佳工作条件下，以蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖混合标准工作溶液（4.9）浓度为横坐标， 以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。用标准工作曲线对样品进行定量。使样品中3种低聚果糖的响应 值在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，蔗果三糖的参考保留时间为11.7min，蔗果四糖参考 保留时间为13.6min、蔗果五糖的参考保留时间为15.1min，3种低聚果糖标准溶液色谱图参见附录A 中图A.1。 6.2.4 标准曲线的绘制 按照6.2.1和6.2.2所列的测定条件，对提取液（6.1）依次进样测定。分别以标准工作溶液中每种低 聚果糖浓度为横坐标，单位以“mg/kg”表示，以对应的峰面积为纵坐标，分别绘制标准工作曲线，得到线 性方程。标准溶液色谱图参见附录A。 按式（1)计算回归参数： y=axr+b ...(1 ) 式中： 标准工作溶液中每种低聚果糖的峰面积； y 回归曲线的斜率； a 标准工作溶液中每种低聚果糖的浓度，单位为毫克每千克（mg/kg）； b 一回归曲线的截距。 结果计算和表述 7 试样中低聚果糖（包括低聚三果糖、低聚四果糖、低聚五果糖等）含量由色谱数据处理软件或按 式（2）计算获得，计算结果需扣除空白值，并保留3位有效数字： 按式（2)计算试样中待测物残留量（mg/kg）： 3 SN/T4783—2017 （2) M×1000 式中： 一试样中待测物的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； X 从标准工作曲线得到的被测组分溶液的浓度，单位为毫克每升（mg/L）； 样液溶液定容体积，单位为毫升（mL）； 最终定容体积试样溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。 M FOS含量Z（mg/100g）按式（3）计算： Z=X果三糖+X蓝果四糖十X盘果五糖 (3) 方法的检测范围和精密度 8.1 检测范围 采用本方法对奶粉中3种低聚果糖含量进行测定，每种低聚果糖的检测范围在1g/kg~70g/kg。 8.2精密度 采用本方法对样品进行添加回收实验，添加水平为每种低聚果糖分别添加1g/kg、35g/kg、 70g/kg的回收率及精密度数据参见附录B。 S SN/T4783—2017 附录A （资料性附录） 不同样品中低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）的色谱图 不同样品中低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）的色谱图见图A.1～图A.3。 mV AD2 1250 1000 750- 0.0 2.5 7.5 0.0 12. 15.0 min 图A.2 米粉中低聚果糖（蔗果 三糖、蔗果四糖 蔗果五糖）的色谱图 mV AD2 200 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min 图A.3 奶粉中低聚果糖（蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖）的色谱图