SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1618—2017 代替SN/T1618—2005 李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Prunus necrotic ringspot virus 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1618—2017 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1618一2005《李属坏死环斑病毒检测方法》。 本标准与SN/T1618—2005相比，主要技术变化如下： 增加了实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：李桂芬、魏梅生、张永江、马洁、孔君。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1618—2005。 SN/T1618—2017 李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了植物检疫中李属坏死环斑病毒检疫鉴定方法。 本标准适用于植物材料中李属坏死环斑病毒的检疫鉴定。 2 基本信息 学名：Prunusnecroticringspotvirus 缩写：PNRSV 分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromovirus），等轴不稳环斑病毒属（Ilarvirus）。 该病毒的其他信息参见附录A。 3 方法原理 根据李属坏死环斑病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行ELISA检测；根据该病毒核酸 序列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定；根据该病毒核酸序列设计特异性引物和 荧光探针，通过检测荧光信号进行结果判定。 仪器设备及试剂 4 4.1 仪器设备 酶标仪、天平（感量，1/10000g）、pH计、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系 统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。 微量移液器(2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)、酶联板、研钵、离心管、花盆、消毒土等。 4.2试剂 测试剂见附录D中D.1。 5样品制备 木本寄主植物选其幼叶、果肉组织和花，草本植物选其叶子。有症状的样品编号单独检测，没有症 状的样品分组（10～15为1组)并编号检测。 6 检测方法 6.1 酶联免疫吸附测定 见附录B。 1 SN/T1618—2017 6.2RT-PCR检测 见附录C。 6.3 实时荧光RT-PCR检测 见附录D。 结果判定 样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行： 首先采用DAS-ELISA进行初步筛检。 若DAS-ELISA检测结果为阳性时， RT-PCR的检测结果为阳性，则判定样品携带PNRSV； 或采用实时荧光RT-PCR进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带PNRSV。 若DAS-ELISA检测结果为阴性时， RT-PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带PNRSV；检测结果为阳性，则对产物进行测 序，测定的序列为PNRSV序列，则判定样品携带PNRSV。 8样品保存 经检测确定携带李属坏死环斑病毒的样品（叶片、花、果实）一80℃保存一年，做好标记和登记 工作。 结果记录与资料保存 完整的记录包括：样品的来源、时间、地点、方法和结果等并要有经手人和实验人员的签字。酶联测 定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测需要有反应 原始数据。 2 SN/T1618—2017 附录A （资料性附录） 李属坏死环斑病毒背景资料 A.1寄主范围 李属坏死环斑病毒病寄主范围十分广泛，自然和人工条件下，病毒可侵染的寄主达21科双子叶植 物，其中可侵染的木本植物有：李属的欧洲李（Prunusdomestica）、桃属的桃（Amygdaluspersica）、樱 属的欧洲甜樱桃（Cerasusavium）、樱属的欧洲酸樱桃（Cerasusulgaris）、杏属的杏（Armeniacauul- garis）、苹果属的苹果（Maluspumila）、蔷薇属的月季花（Rosachinensis）、悬钩子属的椭圆悬钩子（Ru- busellipticus）、秋海棠属的秋海棠（Begoniagrandis）；侵染的草本植物有啤酒花（Humuluslupulus）、 烟草（Nicotianutabacum）、西瓜（Citrulluslanatus）、南瓜（Cucurbitamoschata）、甜瓜（Cucumis melo）、西葫芦（Cucurbitapepo）、菜豆（Phaseolusuulgaris）、豌豆（Pisumsativum）、豇豆（Vignaun guiculata）、草木犀（Melilotusofficinalis）、莴苣（Lactucasativa）、向日葵（Helianthusannuus）、百合 (Liliumbrownii)等。 A.2 病害症状 病害症状因分离物、栽培种和环境条件不同而不同。病毒的一些分离物不引起症状，仅仅在接种指 示植物或用血清学等方法检测时才能发现被侵染；一些分离物在系统侵染的当年在幼叶上产生坏死斑 和孔洞，但在以后的年份里，在叶子和果实上很少出现症状；另一些分离物在侵染当年产生坏死反应，随 后是慢性的褪绿、斑驳和坏死、叶子耳突、畸形、延迟水果成熟，水果上有斑点症状。如在甜樱桃上出现 了从无症状到严重皱缩花叶症状，慢性症状包括叶子上的褪绿点、叶扭曲，水果延迟成熟几天至几周，症 状因病毒分离物不同而不同。在月季上无症状侵染很普遍，症状有花叶、开花延迟、秋天落叶早、产生更 多不成形的花，被侵染的植株通常无活力。在啤酒花上产生褪绿线和环斑。 A.3 3分布地区 分布地区广泛，如欧洲各国和美国都有发生。 A.4 传播方式 机械接种传播、花粉传播、种子传播，也可通过无性繁殖的苗木、组培苗等的运输进行长距离传播。 A.5 5粒体形态 等轴对称球状体，直径23nm～27nm，有些粒体为准等轴球状到短棒状（轴比为1.01～1.5）；有些 株系的粒体呈明显的棒状（轴比大于2.2)；有些棒状粒体达70nm。棒状粒体的有无及比例因株系 而异。 3 SN/T1618—2017 A.6 基因组 正单链RNA，3分体基因组，RNA-1长3.662kb，RNA-2长2.507kb，RNA-3长1.887kb。 SN/T1618—2017 附录B （规范性附录） 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA) B.1试剂 B,.1.1 包被抗体 特异性的李属坏死环斑病毒抗体。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的李属坏死环斑病毒抗体。 B.1.3 底物 对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。 1×PBST缓冲液（pH7.4) B.1.4 氯化钠(NaCI) 8.0 g 磷酸二氢钾（KH2PO） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na2HPO.） 1.15 g 0.2 g 氯化钾(KCI) 吐温-20（Tween-20) 0.5 mL 溶于900mL蒸馏水中，并定容至1000mL，4℃储存。 B.1.5 样品抽提缓冲液（pH7.4) 1.3 g 亚硫酸钠（NazSO） 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW24000~40000） 20.0 g 溶于900mL的1×PBST中，并用1×PBST定容至1000mL，4℃储存。 B.1.6 包被缓冲液（pH9.6) 1.59 g 碳酸钠（Na2CO：） 碳酸氢钠（NaHCO;） 2.93 g 溶于900mL蒸馏水中，并定容至1000mL，4℃储存。 B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4) 牛血清白蛋白(BSA) 2.0 g 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW24000～40000) 20.0 g 溶于900mL1XPBST中，并用1×PBST定容至1000mL，4℃储存。 B.1.8 底物缓冲液（pH9.8) 二乙醇胺 97 mL 5