SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1607—2017 代替SN/T1607—2005 出口饮料中菌落总数、大肠菌群、 粪大肠菌群、大肠杆菌计数方法 疏水栅格滤膜法 Total bacterial count,coliforms,fecal coliforms and Escherichia coli counts indrinksforexport- Hydrophobic grid membrane filtration (HGMF) method 2018-03-01实施 2017-07-21发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1607—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1607一2005《进出口饮料中菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌计数方 法 疏水栅格滤膜法》。 本标准与SN/T1607一2005相比主要技术变化如下： 增加了术语和定义； 修改了范围、方法提要； 细化了试样制备； 在计数时采用了最近似值； 增加了结果的报告方式。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任、 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：韩伟、许镇坚、宁雪。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1607—2005。 I SN/T1607—2017 出口饮料中菌落总数、大肠菌群、 粪大肠菌群、大肠杆菌计数方法 疏水栅格滤膜法 1范围 本标准规定了出口饮料中菌落总数、大肠菌群、类大肠菌群和大肠杆菌的计数方法疏水栅格滤 膜法。 本标准适用于出口包装饮料中菌落总数、大肠菌群、粪类大肠菌群、大肠杆菌的计数。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 疏水栅格滤膜 莫hydrophobicgridmembranefiltration;HGMF 孔径为0.45μm的微孔滤膜，其表面采用无毒疏水材料印有网格，形成和已知大小和数量相等的小 方格。 2.2 最近似值mostprobablenumber；MPN 基于概率理论估算细菌浓度的一种间接计数方法。 3方法提要 一定量的饮料样液通过疏水栅格滤膜时，其中的细菌被截留在疏水栅格内，在指定培养基上培养 后，菌落在栅格之内呈限定生长，计数含特定菌落的栅格数，并通过指定公式换算出细菌的最近似数值。 4 设备和材料 除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下。 4.1疏水栅格滤膜：孔径为0.45μm。 4.2疏水栅格滤器。 4.3抽滤设备。 4.4 培养箱：36℃±1℃，44.5℃±0.5℃。 4.5 无菌吸管：1.0mL和10.0mL，分刻度分别为0.1mL和1.0mL。 5 培养基和试剂 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。 5.1胰化大豆坚固绿琼脂(TSAF)：见附录A中A.1。 1 SN/T1607—2017 5.2m-FC琼脂：见A.2。 5.3胰化大豆硫酸镁琼脂（TSAM)：见A.3。 5.4胰蛋白陈胆汁琼脂(TBA)：见A.4。 5.5吲哚试剂：见A.5。 5.6无菌生理盐水。 6试样制备 6.1 细菌含量较低的样品可用无菌量筒量取50mL直接过滤。 6.2细菌含量较高的样品，用无菌生理盐水将样品制成一系列10倍递增的样品稀释液，根据对污染情 况的估计，选择适宜的稀释度用于检验。通常采用1：100的稀释液，可得出2/mL～10000/mL的计 数范围，若预估计数较高，可用较高稀释倍数的稀释液。制备样品全过程不应超过15min。取50mL 样品稀释液过滤。 6.3若饮料样液中含有可干扰过滤的较大颗粒物，应经粗滤去除后再过滤。 7测定步骤 7.1过滤 将灭过菌的滤器连接到抽滤装置上，用无菌镊子夹取滤膜，将其放置在滤器底部，栅格面向上，用滤 器配套的夹子固定。无菌移取50mL样液至滤器内，打开滤器阀门和真空泵电源进行抽滤；当全部样 液滤过后，加10mL～15mL无菌生理盐水至滤器，重复抽滤步骤；当全部液体通过滤膜后，关闭阀门和 真空泵电源，松开夹子，打开滤器，用无菌镊子夹住滤膜边缘部分取出。 7.2菌落总数测定 7.2.1培养 将7.1的滤膜移放到胰化大豆坚固绿琼脂平板（TSAF)上，栅格面向上，滤膜与琼脂应完全贴紧，两 者间不得留有气泡。36℃土1℃培养48h士2h。 7.2.2计数 除去一个菌落很明显地扩散于相邻方格，应按一个阳性方格计算，计数含有一个或更多菌落的所有 方格为阳性方格，按式(1)求得每毫升样品中的菌落总数最近似值（MPN)： MPN=N ×log.[N(N-α)J×D/50 ..(1) 式中： N 滤膜上的方格总数； 阳性方格数； r D稀释倍数。 7.3 3大肠菌群测定 7.3.1培养 将7.1的滤膜移放到m-FC琼脂平板上，栅格面向上，滤膜与琼脂应完全贴紧，两者间不得留有气 泡。36℃±1℃培养24h士2h。 2 SN/T1607—2017 7.3.2计数 蓝色菌落，包括部分呈蓝色或底部呈蓝色的菌落为阳性菌落。计数所有含阳性菌落的方格数，并以 此数值为工，按式（1)求得每毫升样品中的大肠菌群最近似值（MPN)。 7.4粪大肠菌群测定 7.4.1培养 将7.1的滤膜移放到胰化大豆硫酸镁琼脂平板（TSAM)上，栅格面向上，滤膜与琼脂应完全贴紧， 两者间不得留有气泡。36℃±1℃培养4h～5h，然后将滤膜移至m-FC琼脂平板上，44.5℃土0.5℃ 培养24h±2h。 7.4.2 2计数 蓝色菌落，包括部分呈蓝色或底部呈蓝色的菌落为阳性菌落。计数所有含阳性菌落的方格数，并以 此数值为工，按式（1)求得每毫升样品中的粪大肠菌群最近似值（MPN）。 7.5大肠杆菌测定 7.5.1培养 将7.1的滤膜移放到胰化大豆硫酸镁琼脂平板（TSAM)上，栅格面向上，滤膜与琼脂应完全贴紧， 两者间不得留有气泡。36℃士1℃培养4h～5h，然后将滤膜移至胰蛋白胆汁琼脂平板（TBA）上， 44.5℃±0.5℃培养24h±2h。 7.5.2 2吲哚试验 混合等体积的A液和B液制成吲哚试剂，将无菌滤纸放在无菌培养皿盖中，在滤纸上滴加1mL～ 2mL吲哚试剂使之完全浸润；将经7.5.1培养的滤膜移放到滤纸上，滤膜和滤纸应完全贴紧，两者间不 得留有气泡；室温下保持10min～15min，再将滤膜移回胰蛋白胆盐琼脂平板（TBA)上。 7.5.3计数 粉红色或深红色菌落为阳性菌落。计数所有含阳性菌落的方格数，并以此数值为，按式（1)求得 每毫升样品中的大肠杆菌最近似值（MPN）。 8报告 按7.2.2、7.3.2、7.4.2和7.5.3计数，报告结果每毫升样品中的目标菌的最近似值（MPN）。若所有 稀释度的滤膜上均无菌落生长，报告为MPN<0.02/mL；若所有稀释度的滤膜上所有栅格均有菌落生 长，结果按MPN>10000乘以最高稀释倍数表示。 3 SN/T1607—2017 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 胰化大豆坚固绿琼脂（TSAF) A.1.1成分 1.50 g 胰蛋白陈 大豆陈 5.0 g 氯化钠 5.0 g 0.25 g 坚固绿 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000mL pH 7.3±0.2 A.1.2 制法 将各成分加于蒸馏水中，加热至完全溶解，分装后置于121℃高压灭菌15min。行 待冷却至50℃～ 55℃倾注平皿。4℃～6℃保存不宜超过4周。使用前先从冰箱取出，待恢复室温，且琼脂表面干燥后 使用。 A.2 m-FC琼脂 A.2.1 成分 胰蛋白陈 10.0 g 3号蛋白陈 5.0 g 酵母浸膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 12.5 g 三号胆盐 1. 5 g 苯胺蓝 0.1 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.4±0.2 A.2.2 制法 将各成分加于蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，不需要灭菌，待冷却至50℃～55℃倾注平皿。 4℃～6℃保存不宜超过2周。使用前先从冰箱取出，待恢复室温，且琼脂表面干燥后使用。 4 SN/T 1607—2017 A.3 胰化大豆硫酸镁琼脂（TSAM） A,3.1 成分 胰蛋白陈 15.0 g 大豆陈 5.0 g 5.0 g 氯化钠 1.5 g 硫酸镁 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.3±0.2 A.3.2 制法 将各成分加于蒸馏水中，加热至完全溶解.分装后置于121℃高压灭菌15min。待冷却至50℃～ 55℃倾注平皿。4℃～6℃保存不宜超过2周。1 使用前先从冰箱取出，待恢复室温，且琼脂表面干燥后 使用。 A.4 胰蛋白陈胆汁琼脂（TBA） A.4.1成分 胰蛋白陈 20.0 g 三号胆盐 1.5 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.2±0.2 A.4.2 制法 将各成分加于蒸馏水中，加热至完全溶解，分装后置于121℃高压灭菌15min。待冷却至50℃～ 55℃倾注平皿。4℃～6℃保存不宜超过2周。 使用前先从冰箱取出，待恢复室温，且琼脂表面干燥后 使用。 A,5吲哚试剂 A.5.1 成分 A液 乙醇95% 90 mL 浓盐酸 10 mL 2.5 g 二甲氨基苯甲醛 B液 过硫酸钾 1.0 g 蒸馏水 100 mL 5