ICS67.120.30 QB 分类号：X70 中华人民共和国轻工行业标 QB/T5505-2020 肉类罐头中牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分 检测方法PCR 法 Identification of bovine,sheep,porcine,chicken and duck-derivedmaterials in canned meatPCR method 2020-08-31发布 2021-01-01实施 中华人民共和国工业和信息化部 发布 QB/T5505-2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国食品工业标准化技术委员会罐头分技术委员会（TC64/SC2）归口。 本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院有限公司、广东省食品工业研究所有限公司、厦门市产 品质量监督检验研究院、华测检测认证集团股份有限公司、大连市检验检测认证技术服务中心、北京市 产品质量监督检验院、中国肉类食品综合研究中心、上海梅林正广和股份有限公司。 本标准主要起草人：孟镇、仇凯、谢雪钦、刘彦泓、许银叶、刘文秋、张媛媛、杜星、李家鹏、杨 倩、陈煜、刘岑杰。 本标准为首次发布。 QB/T5505-2020 肉类罐头中牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分检测方法PCR法 1范围 本标准规定了肉类罐头中牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分的PCR检测方法。 本标准适用于肉类罐头中牛、羊、猪、鸡、鸭源性成分定性检测，方法检出限为1%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.26一2013食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair） Ct：阈值循环数（cyclethreshold） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxy-adenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxy-cytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxy-guanosinetriphosphate） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxy-thymidinetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid） FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明（6-carboxytetramethylrhodamine） Taq：水生栖热菌（thermusaquaticus） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris(hydroxymethyl）aminomethane） UNG：尿嘧啶-N-糖基化（uracil-N-glycosylase） 18SrRNA：18S核糖体RNA（18SribosomalacidRNA） 4第一法特异性PCR法（仲裁法） 4.1方法提要 以提取的肉类罐头样品中的总DNA为模板，分别设计牛、羊、猪、鸡、鸭五种成分的特异性引物 进行PCR扩增，以琼脂糖凝胶电泳检测是否出现预期目标片段，再利用限制性内切酶反应或测序进行 确证，从而判定样品中是否含有相应动物源性成分。 4.2试剂和材料 除另有说明外，试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水为GB/T6682一2008规定的一级水。 4.2.1dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 4.2.210×PCR缓冲液：含Mg2+。 1 QB/T5505-2020 4.2.3TaqDNA聚合酶。 4.2.4浓盐酸。 4.2.5氢氧化钠。 4.2.6异硫氰酸胍（GuSCN）。 4.2.7 聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）。 4.2.8 氯仿：异戊醇（24：1，体积比）。 4.2.9 异丙醇。 4. 2.10 无水乙醇。 4.2.11 限制性内切酶：Mnll。 4.2.12 琼脂糖。 4.2.13 溴化乙锭或其他可替代的染料。 4.2.14I DNA分子量标记：100bp。 4.2.15 6xloadingbuffer（上样液）。 4.2.16TE缓冲液：在800mL水中，依次加入1mol/LTris-HC1溶液10mL和0.5mol/LEDTA溶液 2mL，用水定容至1L，121℃灭菌15min，备用。 的三羟甲基氨基甲烷（Tris），冷却至室温后，用浓盐酸调节溶液pH至8.0，用水定容至1L，121℃ 灭菌15min，备用。 4.2.18乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐溶液，0.2mol/L：称取74.45g二水乙二胺四乙酸二钠 （Na2EDTA·2H2O），加入700mL水中，在磁力搅拌器上搅拌，用氢氧化钠调pH至8.0，用水定容至 1L，121℃灭菌15min，备用。 4.2.191×TAE缓冲液：称取242gTris和37.2g的Na2EDTA·2H20放入烧杯中加入约800mL水，充 分搅拌，然后加入57.1mL冰乙酸，用水定容至1L，配制成50×TAE缓冲液，室温保存，使用时用水 稀释为1×TAE缓冲液。 4.2.20异硫氰酸胍裂解液：称取59.1g的异硫氰酸胍放入试剂瓶中，再分别加入0.5mol/L的Tris-HCl 溶液10mL和0.2mol/LEDTA溶液10mL，然后加入TritonX-1001.3mL，用水定容到100mL，121℃ 灭菌15min，备用。 4.2.217 70%乙醇：量取无水乙醇70mL，用水定容至100mL。 4.2.22 琼脂糖凝胶：称取2.0g琼脂糖于锥形瓶中，加入98.0mL1×TAE缓冲液，加热溶解。 4. 2.23 无菌PCR反应管。 4.2.24 无菌离心管：1.5mL、2mL。 4.3仪器和设备 4.3.1超净工作台。 电子天平：感量0.1mg。 4.3.2 4.3.3冷冻离心机。 4.3.4恒温水浴锅。 4.3.5PCR扩增仪。 4.3.6电泳仪。 4.3.7 紫外凝胶成像仪。 4.3.8 灭菌锅。 4.3.9 DNA测序仪/基因分析仪 4.3.10 微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。 2 QB/T5505-2020 4.4分析步骤 4.4.1DNA模板的提取 4.4.1.1样品前处理 按照GB4789.26一2013中6.4规定的方法开启样品；无菌条件下，称取2g～3g固体样品于10mL 离心管中，加入6mL的无菌水，上下颠倒充分混匀，室温条件下9000r/min离心5min并弃去上清液； 再加入6mL的氯仿，室温条件下9000r/min离心5min并弃去上清液；再用无菌去离子水清洗样品一 次；以新鲜的牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉为阳性样品同时进行处理。 4.4.1.2DNA提取 分别称取50mg由4.4.1.1制备的罐头样品和阳性样品于不同的1.5mL离心管中，各离心管中分别 加入200μLTE缓冲液，混匀；加入400μL异硫氰酸胍裂解液，室温放置30min后，加入400μL氯仿： 异戊醇（24：1，体积比），混匀；10000r/min室温离心5min，取上清液，加入80%体积异丙醇，室 温沉淀1h；10000r/min室温离心5min，弃上清液；70%乙醇洗涤1次，晾干；加入TE缓冲液50μL， 溶解后-20℃保存备用。 注：也可用等效DNA提取试剂盒提取样品DNA。 4.4.2DNA浓度和纯度检测 按GB/T34796规定的方法检测DNA浓度和纯度，使OD260/OD280比值在1.7～1.9之间。 4.4.3引物 猪、牛、羊、鸡、鸭的种属特异性引物序列信息及扩增目的片段长度见表1，各引物终浓度均为 10 μmol/L。 表1 种属特异性引物 动物源性成分 引物序列（5"-3"） 预期目的片段/bp F: GCCTAAATCTCCCCTCAATGCTA 猪 212 R:ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG F: CACAATCCAGAACTGACAC 牛 147 R:GATGGCTTGGGAATAGTACGA F: CCTCCAACAGTGAATACTT 羊 202 R: TCCTCCTCATAAAGGAATGGCC F: CTATAATCGATAATCCACGATTCA 鸡 131 R: CTTGACCTGTCTTATTAGCGAGG F: CATCTATCCTGCTAGCCGCC 201 鸭 R:TTGAGTGGAAGAATGCC 4.4.4PCR扩增 4.4.4.1PCR反应采用25μL体系：10×PCRbuffer2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，20pmol/μL引 物各1μL，模板DNA1μL，TaqDNA聚合酶0.3μL（1.5U），MgSO4（50mmol/L）1μL，ddH2O补 足体积。扩增条件为：94℃3min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，35个循环，72℃5min。 4.4.4.2每个PCR反应均设置两个平行试验，并设置空白对照、阳性对照和阴性对照，空白对照的 PCR反应体系中使用无菌双蒸水代