QB ICS67.120.30 分类号：X73 中华人民共和国轻工行业标准 QB/T5504-2020 鱼类罐头中金枪鱼品种鉴别方法PCR法 Method for identification of tuna species in canned fishPCR method 2020-08-31发布 2021-01-01实施 中华人民共和国工业和信息化部 发布 QB/T5504-2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国食品工业标准化技术委员会罐头分技术委员会（SAC/TC64/SC2）归口。 本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院有限公司、广东省食品工业研究所有限公司、厦门市产 品质量监督检验研究院、华测检测认证集团股份有限公司、中国罐头工业协会、大连市检验检测认证技 术服务中心、大连辽渔远洋食品有限公司、北京市产品质量监督检验院、中国肉类食品综合研究中心、 北京市理化分析测试中心、广东左博法政研究院有限公司。 本标准主要起草人：谢雪钦、孟镇、仇凯、谢忠阳、显曦、杨滴、张媛媛、王帅、林兆盛、蒋世卫、 肖辉南、王大伟。 本标准为首次发布。 QB/T5504-2020 鱼类罐头中金枪鱼品种鉴别方法PCR法 1范围 本标准规定了鱼类罐头中金枪鱼品种鉴别方法。 本标准适用于鱼类罐头中长鳍金枪鱼（Thunnusalalunga）、大目金枪鱼（Thunnusobesus）、青干 金枪鱼（Thunnustongoe）、鱼（Katsuwonuspelamis）、东方狐（Sardaorientalis）、巴（Euthymnus affinis）、圆舵（Auxisrochei）、扁舵（Auxisthazard）金枪鱼类的定性鉴别。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB4789.26一2013食品安全国家标准」食品微生物学检验商业无菌检验 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair) CTAB：溴代十六烷基三甲基铵（Cetyltrimethylammoniumbromide） DDBJ：日本DNA数据库（DNAdatabankofJapan） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxy-adenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxy-cytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxy-guanosinetriphosphate） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphat dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxy-thymidine-triphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid） EMBL：欧洲分子生物学实验室/（The european molecular biologylaboratory） mtDNA：线粒体DNA（MitochondrialDNA） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） TAE：三羟甲基氨基甲烷盐酸、乙酸、乙二胺四乙酸（Tris-HCl、Aceticacid、EDTA） Taq：水生栖热菌（thermusaquaticus） TE：三羟甲基氨基甲烷盐酸、乙二胺四乙酸（Tris-HCI、EDTA） 4方法提要 提取金枪鱼罐头样品中的总DNA，以其为模板，以鱼类线粒体基因组（mtDNA）cytB基因为目标 片段设计通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测出现预期目标片段后进行测序，将所得序列与 核酸序列数据库进行同源性比对，获得金枪鱼品种种属信息。 5试剂和材料 除另有说明外，试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水为GB/T6682一2008规定的一级水。 5.1鱼类线粒体基因组（mtDNA）通用引物： 1 QB/T5504-2020 序列为：5'-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTC-3'； 5'-GCTGGTACCTCTACAAAGAAACATGAAACA-3 5.2 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP 5. 3 10×PCR缓冲液：含Mg2 5.4 TaqDNA聚合酶 5.5 浓盐酸。 5. 6 氢氧化钠。 5.7 溴代十六烷基三甲基铵（CTAB） 5.8 异丙醇。 5. 9 无水乙醇。 5.10 琼脂糖。 5.11 溴化乙锭或其他可替代的染料。 5.12 DNA分子量标记：100bp。 5.13 6xloadingbuffer（上样液） 5.14 氯仿：异戊醇（24：1，体积比）溶液。 5.15 氯仿：甲醇：水（1：0.8：0.2，体积比）溶液。 5.16 三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCD）溶液，1mol/L（pH8.0）：在800mL的水中溶解121.1g的 三羟甲基氨基甲烷（Tris），冷却至室温后，用浓盐酸调节溶液pH至8:0，用水定容至1L，121℃灭 菌15min，备用。 5.17乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐溶液，0.5mol/L：称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠 （Na2EDTA·2H2O），加入700mL水中，在磁力搅拌器上搅拌，用氢氧化钠调pH至8.0，用水定容至 1L，121℃灭菌15min，备用。 5.18氯化钠（NaC1）溶液，14mol/L：称取818.2g的NaCl，加入800-mL水溶解，用水定容至1L， 121℃灭菌15min，备用。 5.19TE缓冲液：在800mL水中，依次加入1mol/LTris-HCI溶液10mL和0.5mol/LEDTA溶液2mL， 用水定容至1L，121℃灭菌15min，备用。 5.201×TAE缓冲液：称取242gTris和37.2g的Na2EDTA-2H20放入烧杯中加入约800mL水，充分 搅拌，然后加入57.1mL冰乙酸，用水定容至1L，配制成50xTAE缓冲液，室温保存，使用时用水稀 释为1xTAE缓冲液。 5.21CTAB提取液：称取4g的CTAB放入试剂瓶中，再分别加入1mol/L的Tris-HC1溶液10mL， 14mol/L的NaCl溶液70mL和0.5mol/LEDTA溶液4mL，用水定容至100mL，121℃灭菌15min， 备用。 5.2270%乙醇：量取70mL无水乙醇，用水定容至100mL。 5.23 琼脂糖凝胶：称取2.0g琼脂糖于锥形瓶中，加入1xTAE缓冲液98.0mL，加热溶解。 5.24 无菌PCR反应管。 5.25 无菌离心管：1.5mL 2mL 6 仪器和设备 6.1 超净工作台。 6.2 6.3冷冻离心机。 6.4恒温水浴锅。 6.5PCR扩增仪。 6.6电泳仪。 6.7 紫外凝胶成像仪。 6.8 灭菌锅。 6. 9 基因测序仪。 6.10 微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。 2 QB/T5504-2020 7分析步骤 7. 1 DNA模板的提取 DNA模板提取步骤如下： a）按照GB4789.26一2013中6.4规定的方法开启样品； b）称取金枪鱼罐头肌肉组织样品300mg于2mL无菌离心管中，加入氯仿：甲醇：水（1：2： 0.8，体积比）溶液1mL，室温静置过夜，5000r/min室温离心3min，弃上清，再用无菌去 离子水清洗样品。同时称取300mg金枪鱼阳性样品进行处理； c) 分别称取b)中制备的罐头样品和阳性样品100mg，置于不同的2mL离心管中，分别加入1mL CTAB提取液，置于65℃恒温水浴锅中，温育1h～2h，期间每隔15min颠倒混匀1次； 温育后，10000r/min室温离心5min后移取上清液至一2mL离心管中，加与上清液等体积的 d) 氯仿：异戊醇（24：1）溶液缓慢震荡，10000r/min室温离心5min，重复该步骤1次； 吸取上清液于另一2mL离心管中，加2/3体积预冷的异丙醇在-20℃下静置1h； ) 10000r/min室温离心5min后弃去上清液，加入800μL预冷的70%乙醇进行洗涤两次，然后 10000r/min室温离心5min弃去乙醇，所得沉淀在室温下干燥； 沉淀用100μLTE缓冲液或无菌双蒸水溶解，-20℃保存备用； g) h) 按GB/T34796规定的方法检测DNA浓度和纯度，使OD260/OD280比值在1.7～1.9之间。 注：也可使用等效DNA试剂盒提取样品DNA。 7.2PCR扩增 7.2.1PCR扩增体系（25μL）：10xPCRbuffer（Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，20pmol/μL 引物各1μL，模板DNA2μL，TaqDNA聚合酶0.3μL（1.5U），ddH2O16.2μL。PCR扩增条件为：94℃ 5min，94℃30s，50℃30s，72℃30s，35个循环，最后在72℃延伸5min。 7.2.2每个PCR反应均设置2个平行实验，并设置空白对照、阳性对照和阴性对照，空白对照的PCR 反应体系中使用无菌双蒸水代替DNA模板，阳性对照使用阳性样品提取的DNA或金枪鱼DNA为模板， 阴性对照采用已知不含金枪鱼序列的DNA为模板。 7.