ICS 67.060 QB X 04 中华人民共和国轻工行业标准 QB/T5397—2019 大豆食品中异黄酮含量的测定 Determination of soybean isoflavones in soyfoods 2019-08-02发布 2020-01-01实施 中华人民共和国工业和信息化部 发布 QB/T5397—2019 V 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国食品工业协会提出并归口。 本标准起草单位：苏州金记食品有限公司、中国食品工业协会豆制品专业委员会、国家大豆产业技 术研发中心加工研究室、吉林农业大学食品科学与工程学院、四川省食品药品检验检测院、祖名豆制品 股份有限公司、上海清美绿色食品（集团）有限公司、深圳市福荫食品集团有限公司、山东禹王生态食业 有限公司、长春维石检测技术服务有限公司、上海市豆制品行业协会、合肥市豆制品行业协会。 本标准主要起草人：吴月芳、金兴仓、于寒松、曾祥博、岳清洪、韩晓华、张凡芝、杨金平、刘军、王猛、 张建秋、张之斌、孙玉坤。 I QB/T5397—2019 大豆食品中异黄酮含量的测定 1范围 本标准规定了大豆食品中异黄酮（大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄苷)含 量测定的高效液相色谱法。 本标准适用于原料大豆及豆浆、豆腐、腐乳等大豆食品中异黄酮含量的测定。 本标准测试方法的线性范围：0.5μg/mL100μg/mL。 本标准测试方法的检出限：2.5μg/kg。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 大豆异黄酮 soybeanisoflavones 大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物，以异黄酮葡萄糖苷和相应苷元形式存在的物质，包括大 豆苷（Daidzin）、染料木苷（Genistin）、大豆苷元（Daidzein）、染料木素（Genistein）、黄豆黄素（Glycitein）、 黄豆黄苷（Glycitin）。其分子式如下：大豆苷（CzH2oO。）、染料木苷（C2H2.O1o）、大豆苷元（CisHioO，）、 染料木素（CisH1。O）、黄豆黄素（C1sH12Os）、黄豆黄苷（C22H22O1o）。 4原理 样品经过乙-水溶液振荡提取，提取液经离心、浓缩后用甲醇溶液（体积分数80%）定容、过滤，经 高效液相色谱分析（Cis柱分离），在260nm条件下测定，依据保留时间定性，用外标法定量。 5试剂和材料 本标准使用符合GB/T6682一2008规定的一级水。除另有规定仅使用分析纯试剂。 5.1试剂 5.1.1 甲醇(Methanol,CH:OH)：色谱纯。 5.1.2 乙腈（Acetonitrile，C,HN)：色谱纯。 5.1.3 二甲基亚矾(DMSO,CzH.OS)。 5.1.4 冰醋酸（AceticAcid,CHCOOH)。 1 QB/T5397—2019 5.2试剂配制 5.2.1 甲醇溶液（体积分数80%）：取800mL甲醇（5.1.1)用水定容至1000mL，混匀。 5.2.2 二甲基亚砜-乙睛-甲醇溶液（1：2：2体积比）：取10mL二甲基亚（5.1.3）和20mL乙（5.1.2） 用80%甲醇（5.2.1)定容至50mL，混匀。 5.2.3 乙酸溶液（体积分数0.1%）：取1mL冰醋酸（5.1.4)用水定容至1000mL，混匀。 5.2.4 乙酸乙睛溶液（体积分数0.1%）：取1mL冰醋酸（5.1.4），用乙腈（5.1.2)定容至1000mL，混匀。 5.3 标准品 大豆苷元（Daidzein，CisHi.OCAS号：486-66-8，纯度：≥98%）。 5.3.1 5.3.2 染料木素（Genistein.C.Hi.OCAS号：44672-0.纯度：≥98%） 5.3.3 黄豆黄素（Glycitein，C16Hra0s，CAS号：40957-83-3，纯度：≥98%） 5.3.4 大豆苷（Daidzin，C2H.O，CAS号：552-66-9，纯度：≥98%）。 5.3.5染料木苷 （Genistin，C2H2.O1o，CAS号：529-59-9，纯度：≥98%）。 5.3.6 黄豆黄膏（Glyeitin，C22H22O1o，CAS号：40246-10-4，纯度：≥98%）。 5.4标准品配制 5.4.1 大豆异黄酮标准储备浴液便用分折关 别准确称取6种大豆异黄酮标准品5mg分别 置于容量瓶中，加入5mL 重基亚码艺腊-思解溶液（.2.2） 充分密解配制成1mg/ml的单标标准 储备液。 C避光保存 有效姬个月 -18 5.4.2 大豆异黄酮单标标准简溶液：分别彩取0.5m 豆异黄酮标准储备溶液（5:4.1）加人体积分 mL容瓶中定容混购，配制成 数为80%的甲醇溶液（5. mg/mL单标标准中间溶液。 C冷藏避光保存，存效斯 0℃~4 月。 5.4.3 0.025mL、0.05ml、0.1mlm益02ml手ml容量瓶中，用体积分数为80%的 甲醇溶液（5.21）定容，分别配制成各组分浓为m/ml5g/ml，10μgmL、20μg/mL、 30μg/mL、40%g/ml.50μg/mL、100μg/mL系列大豆异黄酮混合标准工作液用以制作标准曲线。0C~ 4℃冷藏避光保存，有效期1周。 仪器和设备 6.1 高效液相色谱仪：配有四元梯度泵系统、柱温箱、紫外检测器、色谱工作站。 6.2 分析天平：感量0.00001g和0.0001g。 6.3 旋转蒸发仪。 6.4 恒温摇床。 6.5 冷冻离心机：转速不低于8000r/min。 6.6 样品筛：60目。 6.7 超声波振荡器。 6.8 破壁料理机。 6.9 组织粉碎机。 6.10 滤膜：孔径为0.22μm的有机滤膜。 6.11 真空冷冻干燥机。 6.12 液相进样瓶：带有预开口聚四氟乙烯盖的棕色瓶，1.5mL。 2 QB/T5397—2019 7试样制备与保存 7.1试样制备 7.1.1大豆 取样品200g～500g，用组织粉碎机（6.9）粉碎，使其全部通过样品筛（6.6），混匀，装人洁净而干燥 的容器密封备用。 7.1.2豆浆 取100mL豆浆通过真空冷冻干燥机（6.11）制成粉末并记录冻干粉质量，装入洁净而干燥的容器， 密封备用。 7.1.3 豆腐（干）、腐乳等大豆食品 取一定质量 的豆腐或其他豆制品经真空冷冻干燥机（6.11)制成粉末并记录冻干粉质量，装人洁净 而干燥的容器 密封备用。 7.2 试样保存 试样于4℃以下避光保 备过 染或 变化 8操作步骤 8.1提取 准确称取试样0.1g~1精确至0 鲜重间共天05L～ 5mL乙腈（5.1.2）、 0.5mL~5ml水，密封后分派药在幸温条便用温操顾300r/min的速度振荡提取 2h。然后以10000r/min的速度，在25℃下离心5min，取上清液过滤。35℃旋转蒸发仪（6.3）浓缩至 干，向其中加人5ml～10mL甲醇溶液（体积分数80%)以溶解干物质，通过针头式过滤器过0.22μm 有机相滤膜（6.10)过滤上机待测 同时，做试剂空白。 8.2 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a） 色谱柱：C1柱（5μm、4.6mm×250mm），或相当型号色谱柱。 b) 流动相A：含有0.1%乙酸溶液（5.2.3）。流动相B：含有0.1%乙酸乙腈溶液（5.2.4）。 c) 流速：1.2mL/min。 d) 柱温：35℃。 检测波长：260nm。 e) f) 进样量：10μL。 梯度洗脱条件：见表1。 g) 3 QB/T5397—2019 表1梯度洗脱条件 0.1%乙酸溶液/mL 时间/min 0.1%乙酸乙睛溶液/mL 0 58 15 3 84 16 10 82 18 12 80 20 20 76 24 25 73 27 33 69 31 36 65 35 38 85 15 40 85 15 8.3测定 8.3.1定性 分别将大豆异黄酮单标标准中间溶液（5.4.2）按色谱参考条件（8.2）进行高效液相色谱测定，依据单 一标准品的保留时间，对大豆异黄酮各组分进行定性分析，定性色谱图参照附录A。 8.3.2定量 8.3.2.1 标准曲线制作 将不同浓度梯度大豆异黄酮混合标准工作溶液（5.4.3)按色谱参考条件（8.2)进行高效液相色谱测 定，绘制以峰面积为纵坐标、各大豆异黄酮单体浓度为横坐标的标准曲线。 8.3.2.2样品分析 将已进行前处理的试样（7.1)按色谱参考条件（8.2)高效液相色谱测定，保证样品溶液各异黄酮单 体浓度总和在标准曲线检出范围内，若超出线性范围则需要对样品进行适当稀释，得到检测结果后，对 应标准曲线得到原样品溶液中各异黄酮单体的浓度。 9结果与计算 9.1试样中大豆异黄酮各组分含量 按式(1)计算试样中大豆异黄酮各组分含量： (A,-b)×V×> X; = aXm 式中： 试样中各异黄酮单体含量，单位为微克每克（μg/g)； A, 试样样品中各异黄酮单体的峰面积值； 标准线性回归方程中的截距； 6 4 QB/T5397—2019 V 蒸干后重新溶解的体积，单位为毫升（mL）： 入 稀释倍数； D 标准品线性回归方程中的斜率，单位为毫升每微克（mL/μg）； m 样品取样质量，单位为克（g）。 结果保留3位有效数字。 9.2试样中大豆异黄酮总含量 试样中大豆异黄酮总含量按式（2)计算：