SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2462—2010 棉花曲叶病毒检疫鉴定方法 Identification of cotton leaf curl Begomovirus 行业标准信息服务平台 2010-01-10发布 2010-07-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2462—2010 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、浙江大学、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：张祥林、周雪平、朱水芳、王、吴卫、余永杰。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准 行业标准信息服务平台 I SN/T2462—2010 棉花曲叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了棉花曲叶病毒（CottonleafcurlBegomovirus，简称CLCuV)的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能带有棉花曲叶病毒的活体寄主植物的检疫鉴定。 2原理 棉花曲叶病毒的分类地位属于双生病毒科（Geminiviridae）、菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。 该病毒的生物学特性、血清学特性和分子生物学特征是制定本标准的主要依据（参见附录A）。 3仪器设备和用具 3.1仪器设备 电子天平（感量1/1000g）、超净工作台、高速冷冻离心机、小型低速离心机、PH计、恒温水浴锅、微 量榨汁机、超低温冰箱、高压灭菌器、酶标仪、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪等 3.2用具 研钵、培养血、可调式微量移液器（2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000uL)及相应的移液器 头、96孔酶联反应板、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2mL）、量筒、烧杯、镊子。 4试剂、缓冲液及溶液 4.110×PBST缓冲液 氯化钾（KCI)2g、氯化钠（NaCI)80g、磷酸二氢钾（KH2PO4)2g、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O) 11.5g、吐温20（Tween-205mL，用浓盐酸（HCI)调节pH至7.4,加蒸馏水定容至1000mL，4℃条件 下贮存。 4.2样品提取缓冲液 亚硫酸钠（Na2SO3）1.3g、聚乙烯基吡咯烷酮（MW24000～40000,PVP)20g、叠氮钠（NaN3） 0.2g、吐温20（Tween-20)20mL溶解于800mL1×PBST中，用盐酸调节pH至7.4，加1×PBST定 容至1000mL，4℃条件下贮存。 4.3包被缓冲液 碳酸钠（Na2CO3)1.59g、碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g、叠氮钠（NaN3)0.2g，用浓盐酸（HCI)调节 pH至9.6，加蒸馏水定容至1000mL，4℃条件下贮存。 4.4洗涤缓冲液 将1XPBST缓冲液用浓盐酸(HCI)调节pH至7.4,4℃条件下贮存。 4.5酶标抗体缓冲液 1XPBST缓冲液800mL、小牛血清白蛋白（BSA)2g、聚乙烯基吡咯烷酮20g、叠氮钠（NaN3） 0.2g，用无菌蒸馏水定容至1000mL，4℃条件下贮存。 4.6底物（PNPP)缓冲液 二乙醇胺97mL、叠氮钠（NaN3）0.2g，用浓盐酸（HCI）调节pH至9.8，用无菌蒸馏水定容至 1000mL，4℃条件下存。 4.7底物（PNPP)溶液 将4-硝基酚磷酸钠盐（PNPP)100mg溶解于PNPP底物缓冲液100mL中，现配现用。 1 SN/T 2462—2010 4.8终止反应液 氢氧化钠（NaOH)40g，用无菌蒸馏水定容至1000mL。 4.9提取缓冲液A 葡萄糖60g、NaDIECA23g、聚乙烯基吡咯烷酮20g、琉基乙醇0.8mL，溶解于1000mL蒸馏水 中，常温下贮存。 4.10提取缓冲液B 10mmol/LTris-盐酸、20mmol/LEDTA、0.5mol/L氯化钠、1.5%SDS,pH8.0。 4.1110×PCR缓冲液 10mmol/LTris-盐酸，10mmol/L氯化钾。 4.12TAE电泳缓冲液 40 mmol/L Tris-Ac,2 mmol/L Na2 EDTA。 4.13其他试剂 液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、琼脂糖（电泳用）、SYBRGreenI。 也可采用棉花曲叶病毒检测试剂盒。 5检疫鉴定方法 5.1双抗体夹心法（DAS-ELISA) 5.1.1样品制备 取同一批次表现症状的寄主植株叶片和无症状叶片进行混合取样，用微量榨汁机或研钵研磨样品， 其中加入样品提取缓冲液，植株叶片质量与样品提取缓冲液为1：5（g/mL）。将榨出的汁液分别盛装 于Eppendorf管中，4000r/min离心5min后吸取上清液待用。 5.1.2操作步骤 空白对照孔和多个待检测样品孔，待检测样品孔各重复两次。 5.1.2.2每孔加人200μL的CLCuV包被抗体溶液，用封口膜包好，37℃孵育2h～4h（或4℃冰箱 过夜)。 5.1.2.5空干酶标板中的溶液，按5.1.2.3的方法洗涤。 5.1.2.6用酶标抗体缓冲液按要求稀释酶标抗体，每孔加入200μL酶标抗体溶液，用封口膜包好， 5.1.2.7洗涤酶标板，步骤同5.1.2.3。 5.1.2.8每孔加200μL现配的底物溶液，室温避光孵育0.5h1h。 5.1.2.10肉眼观察判断酶标板颜色反应结果，并用酶标仪检测各样品孔和对照孔在A405nm处的吸 收值（OD值）。 5.2PCR法 5.2.1核酸提取 取寄主植物病叶30mg，加人100μL提取缓冲液A，研磨后，10000r/min离心10min，沉淀加人 清液加人2倍体积的乙醇，一20℃放置1h，12000r/min离心10min，沉淀用100μL的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）溶解，贮存于一20℃冰箱中备用 2