SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2428—2010 犬瘟热诊断方法 Diagnostic techniques for canine distemper 行业标准信息服务平台 2010-01-10发布 2010-07-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2428—2010 前言 本标准的附录C为规范性附录，附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：张子群、谢晓峰、岳志芹、何浩、徐义刚、李维刚、由轩、金宁。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T 2428—2010 犬瘟热诊断方法 1范围 定、间接免疫荧光技术、免疫酶试验、免疫酶组织化学试验。 本标准适用于犬瘟热的检疫， 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3概述 犬瘟热（CD)相关资料参见附录A。 CD的诊断可以通过流行病学、临床症状、病理剖检变化对犬瘟热作出初步诊断，对CD作出确诊可 进行病毒分离鉴定、间接免疫荧光技术、免疫酶试验、免疫酶组织化学试验等实验室诊断。 4临床诊断 根据临床症状和病理学检查，参见附录B，可做初步诊断依据。 5实验室诊断技术 5.1病毒分离与鉴定 5.1.1材料准备 5.1.1.1实验材料和试剂 5.1.1.1.1Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）、MDCK细胞（犬肾传代细胞）。 5.1.1.1.2溶液配制：包括细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS等。配方及配置方法见附录C。 信息服务平台 实验用水应符合GB/T6682要求。 5.1.1.2设备和器材 5. 1. 1. 2. 1 细胞培养瓶、细胞培养板。 5. 1. 1. 2. 2 吸管。 5.1.1.2.3 二氧化碳培养箱。 5. 1. 1. 2. 4 37℃恒温水浴箱。 5. 1. 1.2.5 普通冰箱和低温冰箱。 5. 1. 1. 2. 6 离心机及离心管。 5. 1. 1. 2. 7 研磨器械。 5. 1. 1. 2. 8 普通光学显微镜和倒置显微镜。 5. 1. 1. 2. 9 微量加样器，容量5μL~50μL，50μL~200μL。 1 SN/T 2428—2010 5. 1. 1. 2. 10 0.45um微孔滤器。 5.1.1.3组织悬液的制备 CDV存在于病犬心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用加双抗（含青 霉素2000IU/mL、链霉素2000μg/mL）的细胞维持液，制成20%组织悬液，4℃浸泡4h，然后反复冻 融3次，3000r/min离心30min，取上清液，一20℃冷冻保存，备用。试验前，10000r/min离心 20min，取上清液，用于CDV分离， 5.1.2操作方法 5.1.2.1细胞分离法 用常规方法培养细胞单层，待长至80%左右时，用于CDV分离。吸去培养液，用无血清培养液洗 涤1次。如用细胞培养瓶，按1mL/25cm接种处理好的组织上清液，每样接种两瓶；如用细胞培养 板，则按每孔0.1mL接种处理好的组织上清液，每样接种2孔。33℃吸附1h，弃去上清液，加入细胞 维持液，置37℃5%二氧化碳培养箱内培养，24h后逐日观察细胞病变，连续观察5d～7d。 5.1.2.2结果观察 和空泡形成，随后形成巨细胞和合胞体，并在胞浆内出现包涵体。若第一次接种后未出现细胞病变，应 将细胞培养物冻融后盲传三代，进行观察。如仍无细胞病变，则判为CDV检测阴性。 5.1.2.3CDV的鉴定 将出现细胞病变的细胞培养物，按5.2进行鉴定；或按5.3的方法制备细胞涂片，用CDV单克隆抗 体进行鉴定。 5.2间接免疫荧光技术 5.2.1材料准备 5.2.1.1试剂 5.2.1.1.1磷酸盐缓冲液（PBS)：配制见附录C。 5.2.1.1.2CDV单克隆抗体：使用前稀释成适当的工作浓度， 5.2.1.1.3FITC荧光素标记羊抗鼠IgG抗体：使用前用0.02%伊文斯蓝稀释至工作浓度 5.2.1.1.4碳酸盐缓冲甘油：配制见附录C。 5.2.1.2器材 5.2.1.2.1荧光显微镜。 5.2.1.2.2可调微量加样器（5μL～50μL,50μL~200μL,100μL~1000μL）。 5.2.1.2.337℃恒温水浴箱。 5.2.1.2.4载玻片和盖玻片。 5.2.1.3样品 5.2. 1. 3. 1 细胞培养物：按5.1用24孔细胞培养板进行病毒分离培养，出现细胞病变的培养孔，吸去 细胞维持液，用PBS漂洗，自然干燥。 5.2.1.3.2血液涂片：无菌采取待检犬静脉末端血，直接涂片，室温条件下自然干燥。 5.2.1.3.3组织涂片：死亡动物脏器组织（如：肝、脾、肺、脑、淋巴结等），制成涂片 5.2.2操作方法 5.2.2.1将细胞培养物、血液涂片、组织涂片用一20℃预冷的丙酮固定10min。 5.2.2.2将固定好的细胞培养物、载玻片用PBS浸泡5min，置于37℃40min，干燥。 5.2.2.4PBS漂洗3次，每次5min；再用蒸馏水浸泡1min，自然干燥或风干。 5.2.2.5在细胞面上或组织面上滴加稀释成适当工作浓度的免疫荧光抗体，37℃平放湿盒中30min， 取出。 2