ICS 65.060.99 B 90 T/ZNZ 浙 江 省 农 产 品 质 量 安 全 学 会 团 体 标 准 T /ZNZ 030—2020 水产品中氯霉素残留的快速检测 胶体金免 疫层析法 Rapid detection of chloramphenicol r esidues in aquatic products -Colloidal gold immunochromatographic method 2020 - 09 - 15发布 2020 - 10 - 15实施 浙江省农产品质量安全学会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 030-2020 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020给出的规则起草。 本文件由浙江省农产品质量 安全学会 提出并归口。 本文件起草单位： 浙江省水产技术推广总站（浙江省渔业检验检测与疫病防控中心）、杭州 市农业科学 研究院、杭州南开日新生物科技有限公司、江苏美正生物科技有限公司。 本文件主要起草人 : 王扬、桑丽雅、柯庆青、赵芸、周以琳、刘超、李诗言、沈清、陆炜、 吴洪喜。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 030 -2020 2 水产品中氯霉素残留的快速检测 胶体金免疫层析法 1 范围 本文件规定了水 产品中氯霉素残留的免疫胶体金快速筛查检测方法。 本文件适用于鱼、虾、蟹、龟鳖、贝类等水产品肌肉等可食部分中氯霉素残留的快速筛查检 测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引 用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修 改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20756 可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液 相色谱 -串联质谱法 GB/T 30891 -2014 水产品抽样规范 农业部 958号公告 -13-2007 水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定 气相色谱 法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 本方法应用竞争抑制免疫层析原理，样品经有机试剂提取、净化、浓缩、复溶后，滴加在氯 霉素免疫胶体金快速检测试剂条加样孔中，样品中氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结 合，未被氯霉素结合的抗体与检测线 （T线）上的抗原反应显色，用胶体金读卡仪或目测比较板 上控制线（ C线）和检测线（ T线）上红色条带的有无及颜色相对深浅， 对样品中氯霉素含量进 行定性判定。 图1 免疫胶体金 快速检测试剂条测定示意图 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 030-2020 3 5 试剂和材料 5.1 乙酸乙酯 （C4H8O2） 5.2 正己烷（C6H14） 5.3 氯霉素标准物质（ C11H12Cl2N2O5）： CAS号 56-75-7，分子量为323.1294。纯度≥ 99.5%。 5.4 氯霉素标准溶液：精确称取 0.010g氯霉素标准物质 (5.3)，用甲醇溶解，定容到 100mL， 配成 100μg/mL的标准储备溶液，于 -18℃保存，有效期 12个月；移取适量标准储备溶液，用甲 醇稀释成 20ng/mL 中间浓度标准液，于 4℃保存，有效期 3个月；使用时，用水稀释中间浓度标 准液，配成适当浓度的 标准使用溶液，现配先用。 5.5 PBST缓冲液：溶解 8.0g氯化钠、 0.2g氯化钾、 1.44g磷酸氢二钠 (Na 2HPO 4·12H 2O)、0.24g 磷酸二氢钾、 0.5mL吐温 -20于800mL水中，加水溶解并定容至 1000mL，过滤，经121℃灭菌 15min。 5.6 氯霉素免疫胶体金 快速检测 试剂条：密封包装，干燥阴凉处保存，用前恢复至室温（ 20℃ ±5℃），即开即用。 若试剂条需要验证时，具体方法和性能指标见附录 A。本方法所述试剂、 试剂条信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。 5.7 除特殊注明外，本法所用 试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。 6 仪器和设备 6.1 电子天平：感量 0.01 g和0.001 g。 6.2 均质机：转 速≥8000 r/min 。 6.3 离心机：离心 力≥4 000 g。 6.4 氮气或空气吹干仪：加热温度 ≥60 ℃。 6.5 微量移液器： 10 μL～100 μL，100 μL～1 000μL。 6.6 胶体金读卡仪（必要时）。 7 测定步骤 7.1 抽样 按照 GB/T 30891 要求进行抽样，参考 附录表 B.1填写采样 信息记录。 7.2 试样制备与保存 按照 GB/T 30891 -2014附录 B规定进行各类水产品制样，将样品分割 成小块后混合， 用均质机 制成糜状，分成检样和备样两份并做好标记，每份不少于 50g；检样立即测试或 -18℃以下冷冻待 测，备样 -18℃以下冷冻保藏，有效期不超过 3个月。 7.3 提取与净化 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 030 -2020 4 准确称取2.00g均质后的试样， 于5mL离心管中，加入 3mL乙酸乙酯（ 5.1），剧烈振荡 3min， 室温下于 4 000r/min离心5min；移取2 mL上清液，于5 mL离心管中 ，在65℃下用氮气或空气吹 干；依次加入 0.3mL正己烷（ 5.2）和0.3mL PBST缓冲液（ 5.5），用滴管冲洗 离心管内壁上残留 物；静置分层 后，吸取下层溶液待 测。 7.4 测定 氯霉素免疫胶体金 快速检测 试剂条（5.6），恢复至室温后， 从包装袋中取出，置于 水平台 面上。吸取 7.3中待测液的下层溶液 100 μL， 加至氯霉素免疫胶体金快速检测 试剂条的加样孔中， 在5 min～8min内读取检测结果。 7.5 质控试验 每批样品应同时进行空白试验和 阴性、阳性对照 质控试验。 7.5.1 空白试验 每批样品需做一孔空白对照，以 PBST缓冲液（5.5）代替试样提取液，按 7.4进行。 7.5.2 阴性对照 称取空白样品，按 7.3和7.4进行。 7.5.3 阳性对照 在空白样品加入一定量氯霉素 标准溶液（其含量 ≥检测限），按 6.3和6.4进行。 8 结果判断 及表述 8.1 试剂条有效性判定 8.1.1 有效检测 试剂条：空白对照控制线（ C线）和检测线（ T线）均出现红色条带，而且 T 线颜色达到或 深于C线（如图 2-1），则检测 试剂条有效，可进行检测 ； 8.1.2 失效检测 试剂条：空白对照控制线（ C线）不出现红色条带（如图 2-3），则检测 试剂条 失效，不能进行检测 。 8.2 结果和表述 8.2.1阴性 试样检测线（ T线）出现红色条带，且颜色达到或深于控制线 （C线）为阴性。结果表述： 阴性（氯霉素残留量 <检测限）。 8.2.2阳性 试样检测线（ T线）出现红 色条带，但颜色浅于控制线（ C线）或检测线（ T线）未出现红 色条带（如图 2-2），为阳性。结果表述：阳性（氯霉素残留 量≥检测限）。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 030-2020 5 图2-1 图2-2 图2-3 8.3 试剂条验证 试剂条性能验证参照附录 A.1 执行。 8.4 试验质控要求 操作人员需经过专业培训，具备一定的相关工作经验。宜选用按 8.3进行验证，结果符合附 录A.2中各项性能指标的试剂条，按照说明书要求规范操作。 同检测批不低于 10%比例的平行样和 2个阴性控制样品测定，同时加做 2个阳性质控样 (大于检测限和检测限 各一个 )，进行阴性和阳性 对照质控试验 ；当平行样的检测结果完全一致，且阴性控制样品和阳性质控样的结果准确时，判 定该批检测数据有效。 8.5试验报告 参照附录表 B.2 记录试验结果。 9 复检和确证 若初检结果为阳性，需要按照 7、8重新检测；重复检测结果仍为阳性，需要采用参比方法 确认。参比标准为《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱 -串联质谱法》（ GB/T 20756 -2006）和《水产品中氯霉素、甲砜 霉素、氟甲砜霉素残留 量的测定 气相色谱法》（农业部 958号公告 -13-2007）及其它符合要求的国家和行业标准 。当结 果判定为阳性时， 以参比标准方法确证结果为最终报告值 ，参照附录表 B.3填写。若有必要时， 阴性结果样品也可采用 参比标准方法 确认。 全国团体标准信息平台 T/ZNZ 030 -2020 6 附录A （规范性 附录） 试剂条验证方法和性能指标要求 A.1 验证方法 空白和添加检测限浓度的验证样品分别不少于 20个，可以选择低脂鱼、高脂鱼、龟鳖、虾 蟹、贝类等至少 5种水产品基质。参照试剂条说明书操作