ICS11.020 CCSC61WS 中华人民共和国卫生行业标准 WS/T792—2021 日本血吸虫抗体检测标准酶联免疫吸附 试验法 DetectionstandardofantibodyagainstSchistosomajaponicum—Enzyme-linked immunosorbentassay 2021—11—23发布 2022—05—01实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会发布WS/T792—2021 I前  言 本标准由国家卫生健康标准委员会寄生虫病标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由中国疾病 预防控制中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委疾病预防控制局负责业务管理、法规司负责统 筹管理。 本标准起草单位：杭州医学院（浙江省医学科学院）、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、 安徽省血吸虫病防治研究所、宁波市疾病预防控制中心、江西省寄生虫病防治研究所。 本标准主要起草人：闻礼永、严晓岚、熊彦红、郑彬、张剑锋、汪天平、俞丽玲、许国章、林丹丹、 周晓农。WS/T792—2021 2日本血吸虫抗体检测标准酶联免疫吸附试验法 1范围 本标准规定了检测日本血吸虫抗体的酶联免疫吸附试验方法。 本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对人体血清中日本血吸虫抗体的检测。 2规范性引用文件 本标准没有规范性引用文件。 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 酶联免疫吸附试验enzyme-linkedimmunosorbentassay；ELISA 利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物上之抗原或抗体仍 可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并 可利用呈色之深浅进行定量分析的试验。 3.2 可溶性虫卵抗原solubleeggantigen 血吸虫虫卵经匀浆和超声破碎等处理后离心收集的上清液，含蛋白质、糖蛋白、多糖等多种成分复 合物。 3.3 金黄色葡萄球菌蛋白AstaphylococalproteinA 从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，能与人及多种哺乳动物血清中IgG分子的Fc片段结合，作 为第二抗体。 4仪器设备 4.1台式低速离心机 最高转速大于或等于2500r/min，或最大相对离心力大于或等于800g。 4.2酶标专用比色计 带有450nm、492nm和630nm滤光片，分辨率0.001光密度（opticaldensity，OD）值。 4.3恒温水浴箱WS/T792—2021 3控温范围5℃～99.9℃，温度分辨率/波动度0.1℃/±0.5℃。 4.4微量移液器 量程范围1μL～10μL，增量0.1μL；量程范围10μL～100μL，增量1μL；量程范围100μL～1000μL， 增量5μL。 5试剂或材料 5.1酶标反应板 96孔或40孔微量聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料凹孔反应板。 5.2包被抗原 可溶性虫卵抗原，制备方法见附录A中A.1。 5.3包被缓冲液 0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液，制备方法见附录A.2。 5.4样品洗涤液 含0.05%吐温-20的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液（PBS-T），制备方法见附录A.3。 5.5封闭液 2%牛血清白蛋白（BSA），制备方法见附录A.4。 5.6阳性对照血清 感染日本血吸虫的兔混合血清，制备方法见附录A.5。 5.7阴性对照血清 健康兔混合血清，制备方法见附录A.6。 5.8样品稀释液 含0.1%BSA的PBS-T，制备方法见附录A.7。 5.9酶标记物 金黄色葡萄球菌蛋白A标记辣根过氧化物酶，制备方法见附录A.8。 5.10底物缓冲液 pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液，制备方法见附录A.9。 5.11底物使用液 3,3’，5,5’-四甲基联苯胺（TMB）或邻苯二胺（OPD），制备方法见附录A.10。 5.12终止液 2mol/L硫酸，制备方法见附录A.11。WS/T792—2021 46检测步骤示意图和注意事项见附录B。 6.1样本准备 采集末梢血100μL或静脉血2mL，室温下放置至血块收缩后，800g离心5min，分离出血清进行 检测。 6.2样本检测 6.2.1抗原包被 于酶标反应板凹孔中，加入100μL以包被缓冲液1:1000～1:3000稀释的可溶性虫卵抗原，置4℃ 冰箱过夜。次日，倾去抗原，用样品洗涤液洗涤3次，每次3min～5min，甩干。为减少非特异性反应， 小孔中可再加100μL封闭液过夜，甩干。4℃保存备用。 6.2.2加受检和对照血清 用样品稀释液1:100比例稀释受检者、阴性对照和阳性对照血清，各取100μL稀释血清加入酶标 反应板的小孔中，每板同时设置两孔阴性对照血清、一孔阳性对照血清和一孔样品稀释液空白对照，置 恒温水浴箱内37℃孵育1h。如6.2.1洗涤甩干。 6.2.3加酶标记物 用样品缓冲液1:1000～1:4000比例稀释酶标记物，取100μL加入酶标反应板的小孔中，置恒温水 浴箱内37℃孵育1h。如6.2.1洗涤甩干。 6.2.4加底物 每孔加入新配置的底物使用液100μL，置恒温水浴箱内37℃反应30min。 6.2.5终止反应 每孔加入50μL终止液终止反应。 6.2.6结果判定 以空白对照调零，读取酶标专用比色计上各孔450nm（TMB为底物）或492nm（OPD为底物） 波长的OD值，以630nm作为参比波长。 以受检样本孔OD值/阴性对照孔OD值（P/N）≥2.1倍判为阳性。当阴性对照OD值低于0.05时， 按0.05计算。WS/T792—2021 5AA 附录A （资料性） 主要试剂材料制备方法 A.1包被抗原 取冻干虫卵，0.01%硫柳汞生理盐水配制悬液，组织匀浆器研磨并置﹣20℃反复冻融3次，10000g 离心30min，取上清液。测定蛋白含量后，用硫柳汞生理盐水稀释至0.75mg/mL，分装后置﹣20℃保存 备用。 A.2包被缓冲液 称取碳酸钠（Na2CO3）1.59g，碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g，加去离子水（或蒸馏水）至1000mL， 即为0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液，密封盖好，4℃保存备用，有效期2周。 A.3样品洗涤液（PBS-T） 称取磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）2.9g，氯化钠（NaCl） 8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，加去离子水（或蒸馏水）至1000mL，即为0.15mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液 （PBS），再加0.5mL吐温-20，即配成含0.05％吐温-20的洗涤缓冲液（PBS-T），4℃保存备用。 A.4封闭液 称取2gBSA，加入PBS-T缓冲液100mL，即为2%牛血清白蛋白，4℃保存备用。 A.5阳性对照血清 选择体重2.5kg～3.0kg的健康家兔，每只感染800条～1000条日本血吸虫尾蚴，饲养60d后，抽取 心脏全血，分离血清，混合后按每支0.1mL分装于微量离心管冻干，作为阳性对照血清。阳性对照血清 检测效价不低于1：640。 A.6阴性对照血清 选择体重2.5kg～3.0kg的健康家兔，抽取心脏全血，分离血清，选出没有溶血的血清灭活补体（56℃ 灭活30min），混合后按每支0.1mL分装微量离心管冻干，作为阴性对照血清。阴性对照血清检测效价 不高于1：5。 A.7样品稀释液 称取0.1gBSA，加入PBS-T缓冲液至100mL，4℃保存备用。 A.8酶标记物WS/T792—2021 6常用过碘酸钠法标记。称取5mg辣根过氧化物酶（HRP）溶于0.5mL蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5mL，混匀置4℃30min，取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液0.5mL， 室温放置30min后，加入含5mg纯化抗体的水溶液1mL，混匀并装透析袋，在0.05mol/LpH9.5碳酸缓 冲液缓慢搅拌透析6h或过夜，然后加5mg/mL硼氢化钠（NaBH4）溶液0.2mL，置4℃2h。将上述结 合物混合液加入等体积饱和硫酸铵，4℃30min后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/LpH7.4磷 酸盐缓冲液中，并透析过夜，次日离心除去不溶物，即得酶-抗体结合物，用磷酸盐缓冲液加至5mL进 行测定后冷冻干燥保存。 A.9底物缓冲液 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）28.4g，加去离子水（或蒸馏水）至1000mL，为A液；称取柠檬酸19.2 g，加去离子水（或蒸馏水）至1000mL，为B液。取A液25.7mL，B液24.3mL混合，并加去离子水（或 蒸馏水）50mL，即为pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液。现配现用。 A.10底物使用液 A.10.1TMB使用液 称取100mgTMB溶解在10mL二甲基亚砜（DMSO）或无水乙醇中，配成1%TMB溶液，4℃保存 6个月以内使用。用底物缓冲液9.9mL加入0.1mL1%TMB保存液，使用前，按每1mLTMB溶液加入30% 过氧化氢（H2O2）1μL，混匀后立即使用。 A.10.2OPD使用液 称取4mgOPD溶解在10mL底物缓冲液中，再加30%H2O215μL，避光保存。使用前现配现用。 A.11终止液 蒸馏水178.3mL，逐滴加入98%浓硫酸21.7mL，即为2mol/L终止液。WS/T792—2021 7BB 附录B （资料性） 检测步骤和注意事项 B.1检测步骤 检测步骤示意图见图B.1。 图B.1检测步骤示意图