ICS 11.020 C62 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标准 WS/T 569—2017 疟原虫检测 血涂片镜检法 Microscopic examination of blood films for malaria parasites 2017-08-01发布 2018-02-01实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发布 WS/T 569—2017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准起草单位：海南省疾病预防控制中心、江苏省寄生虫病防治研究所、中国疾病预防控制中 心 寄生虫病预防控制所、云南省寄生虫病防治所、海南省农垦总局医院 。 本标准主要起草人：王善青、高琪、汤林华、杨恒林、郑彬、胡锡敏、王光泽、李雨春、刘莹、欧 阳范献。 WS/T 569—2017 1 疟原虫检测 血涂片镜检法 1 范围 本标准规定了 血涂片镜检法 检测疟原虫的技术规范 。 本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原虫的显微镜检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 2.1 疟原虫Plasmodium spp 疟原虫是一类单细胞、寄生性的真核动物，是疟疾（ malaria）的病原体。寄生于人体的疟原虫主 要有恶性疟原虫 （ Plasmodium falciparum ） 、 间日疟原虫 （ Plasmodium vivax ） 、 三日疟原虫 （ Plasmodium malariae ）和卵形疟原虫（ Plasmodium ovale ）等。 2.2 血涂片 blood films 将血液涂制于载玻片上制成的涂片。 供显微镜疟原虫检查用的血涂片包括厚血膜涂片和薄血膜涂片 两种。 3 仪器和器材 3.1 生物显微镜（ 100×油浸物镜、 5×或10×目镜） 。 3.2 计数器。 3.3 载玻片（无划痕无油污的洁净载玻片） 。 3.4 推片。 3.5 血片染色架 。 3.6 血片干燥架 。 3.7 玻片盒。 3.8 染色盘和染色缸 。 4 试剂和材料 WS/T 569—2017 2 4.1 吉氏染色原液 。 4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（ PBS）。 4.3 甲醇（分析纯） 。 4.4 香柏油或专用浸油（折射率 ≥1.5）。 4.5 二甲苯（分析纯） 。 4.6 75%酒精。 4.7 一次性采血针 。 4.8 一次性手套 。 5 检测步骤 5.1 血涂片的制作 5.1.1 采血部位及取血方法 经75%乙醇消毒采血部位，待干后，用一次性采血针在耳垂或指端扎刺取血，婴儿可从拇趾或足跟 扎刺取血。取 1张已消毒推片，用拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片左下角刮取血液 4μL～5μL用于 制作厚血膜，再用该端中部刮取血液 1μL～1.5μL用于制作薄血膜。 5.1.2 厚血膜制作 取1张载玻片，将推片左下角的血滴涂于载玻片的中央偏左，由里向外划圈涂成直径 0.8cm～1.0cm 的圆形厚血膜 ,厚度以 1个油镜视野内可见到 5个～10个白细胞为宜。 5.1.3 薄血膜制作 用干棉球抹净推片左下角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之 间向两侧扩展至约 2cm宽时，使 2张玻片保持 25°～35°，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。每张载玻片 上1个厚血膜和 1个薄血膜（参见附录 A）。 5.1.4 编号 血膜制好后水平放置，充分干燥后，用铅笔在玻片一侧毛玻璃上或在薄血膜上编号。 5.2 固定与溶血 5.2.1 薄血膜固定 将薄血膜一端朝下呈 45°，用棉签蘸取甲醇溶液，均匀轻抹于薄血膜表面，避免碰触厚血膜。 5.2.2 厚血膜溶血 在干燥的厚血膜上滴加蒸馏水数滴，完全覆盖血膜，溶血数分钟，待血膜呈浅灰色，倾去溶血液。 厚血膜制作后 1d内染色无需溶血，超过 1d的应溶血。 5.3 吉氏染色 WS/T 569—2017 3 5.3.1 吉氏染液的配制（参见附录 B） 吉氏染液包括吉氏染液原液和吉氏染液工作液。 吉氏染液原液由 5g吉氏粉加 250mL甘油充分研磨后 加入 250mL甲醇配制。吉氏染液原液在避光条件下可长期保存。常用的吉氏染液工作液包括 2%，3%和 10%浓度三种，分别由吉氏染液原液和 pH 7.2 磷酸盐缓冲液（ PBS）按比例配制。吉氏染液工作液只能 使用时新鲜配制。 5.3.2 单张血涂片染 色（参见附录 C） 单张血涂片吉氏染色常用于临床疟疾患者的显微镜疟原虫检测。采用 3%吉氏染液的常规染色方法 血涂片染色质量较好，可长期保存，染色时间约 30min。采用 10%吉氏染液的快速染色方法染色时间较 短，8 min ～10min，但血涂片不适合长期保存。 5.3.3 成批血涂片染色（参见附录 C） 成批血涂片吉氏染色常用于人群流行病学调查中的显微镜疟原虫检测，常采用 2%吉氏染液进行批 量血涂片染色。 5.4 镜检 5.4.1 显微镜检查 在染色后的血膜上加 1滴香柏油或专用浸油，用 100×油浸物镜、 5×或10×目镜的光学显微镜检查。 染色质量较好 的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红色，嗜中性粒细胞核呈紫蓝色，淋巴 细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，疟原虫核呈红色。除环状体外，其他各期均可查见疟色素。疟原虫 检测以厚血膜为主，虫种鉴别以薄血膜为主。看片路线顺序为薄血膜从舌尖部分开始，厚血膜从上端或 下端开始（参见附录 D）。 5.4.2 结果判定 5.4.2.1 疟原虫检测阴性 厚血膜在油镜下，最少检查 100个视野或整个厚血膜未查见疟原虫方可判为阴性。 5.4.2.2 疟原虫检测阳性 血膜中查到疟原虫判定为阳性，并根据疟原虫形态 (参见附录 E)确定恶性疟原虫、间日疟原虫、三 日疟原虫、卵形疟原虫或 混合感染。 5.4.3 疟原虫的计数 5.4.3.1 厚血膜的疟原虫计数法 镜检厚血膜，计数每个视野中的疟原虫数和白细胞数，计数 200个白细胞以上，疟原虫密度很低时 计数 1000个。用下式算出疟原虫密度。疟原虫数 ÷ 白细胞数 × 每微升血中白细胞数 = 疟原虫数 ／微 升血。如果无法进行白细胞计数，则以 8000个白细胞 ／微升血计算。 5.4.3.2 薄血膜的疟原虫计数法 镜检薄血膜，计数每个视野中的疟原虫数和红细胞数，计数 1000个红细胞以上。用下式算出疟原虫 密度。疟原虫数 ÷红细胞数 ×每微升血中红细胞数＝疟原虫数 ／微升血。如果无法进行红细胞计数，则WS/T 569—2017 4 以男性 500万个／微升血、女性按 450万个／微升血计算。薄血膜的疟原虫计数法适用于疟原虫密度很高 时（每微升血中疟原虫数 >16000个）的疟原虫计数。 5.5 血涂片保存 用吸水纸吸去已检血涂片血膜表面的香柏油 或专用浸油 ，在血膜上滴加 2滴～3滴二甲苯，然后用吸 水纸吸干（专用浸油无需用二甲苯清洗，可直接用吸水纸吸干）。置血涂片于玻片盒内，避光、干燥和 阴凉保存，以备复核。 WS/T 569—2017 5 A A 附 录 A （资料性附录） 厚血膜和薄血膜血涂片制作示意图 厚血膜和薄血膜血涂片制作示意图 见图A.1。 图A.1厚血膜和薄血膜血涂片制作示意图 WS/T 569—2017 6 B B 附 录 B （资料性附录） 吉氏染液的配制 B.1 吉氏染色原液配制 吉氏粉5.0g，甲醇250mL，甘油250mL。 将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入 500mL有塞 深色玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至 甲醇洗净研钵中甘油为止。塞紧瓶塞，置室温内，每天用力摇动溶液 5min，3d后即可使用。 注意事项：将瓶塞塞紧，以避免蒸发和高湿造成的氧化；储存在深色的玻璃瓶中，避免阳光直射，储存 时间越久染色效果越佳。根据日常的需求，用干燥吸管吸取少 量的染色原液到密闭的分装瓶中（大约 25mL） 。切勿向原液中加入水。 B.2 pH 7.2 磷酸盐缓冲液（ PBS）的配制 先制备好两种贮备溶液。溶液 I为9.5g无水磷酸氢二钠加蒸馏水至 1000mL，溶液II为9.07g磷酸二氢 钾加蒸馏水至 1000 mL。制备时将磷酸盐置于容量瓶中，加入部分蒸馏水摇匀使溶解后，再加入蒸馏水 稀释至1000 mL，充分摇匀，塞紧备用。临用时，取 73 mL溶液I和27 mL溶液II，倒入1000 mL容量瓶中， 加入部分蒸馏水， 混合摇匀后， 再加入蒸馏水稀释至 1000mL的刻度， 塞紧瓶塞反复摇匀 后， 即配制成 pH7.2 的缓冲溶液。 B.3 吉氏染色工作液的配制 B.3.1 3%吉氏染色工作液的配制 在97mLpH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入 3 mL吉氏染色原液并混匀。 B.3.2 10%吉氏染色工作液的配制 在9mLpH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入 1 mL吉氏染色原液并混匀。 B.3.3 2%吉氏染色工作液的配制 在98mLpH 7.2 磷酸盐缓冲液中加入 2 mL吉氏染色原液并混匀。 B.3.4 注意事项