ICS67.050 CCSX04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5406—2021 进口食用植物油中转基因成分检测方法 Detectionofgeneticallymodifiedcomponentsinediblevegetableoilforimport (报批稿) 2021-11-22发布 2022-06-01实施 中华人民共和国海关总署发布 以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T1.1—2020和GB/T20001.4—2015给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国广州海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国天津海关、 中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国深圳海关。 本文件主要起草人:董洁、刘津、王毅谦、梁颖婕、王仲敏、孙敏、李想、潘广、龙云凤、贺艳、高宏伟、 尹璐、高东微、李荀、陈文锐。 ⅠSN/T5406—2021 以正式出版文本为准以正式出版文本为准进口食用植物油中转基因成分检测方法 1 范围 本文件规定了进口食用植物油中转基因成分的定性检测方法。 本文件适用于初榨大豆油、菜籽油、玉米油和棉籽油中转基因成分实时荧光PCR定性检测。其他 类型的食用植物油可以参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检验 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 adhC:乙醇脱氢酶C基因(alcoholdehydrogenaseCgene) bar:磷化麦黄酮乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyltransferasegene) CP4-EPSPS:根癌农杆菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(Agrobacteriumtumefaciens strainCP4Product:herbicidetolerantformof5-enolpyruvulshikimate-3-phosphatesynthase) CruA:十字花科种子储藏蛋白基因(CruciferinAgene) GOX:草甘膦氧化还原酶基因(glyphosateoxidoreductasegene) hmgA:高移动性蛋白家族基因A(high-mobility-groupgeneA) nptII:新霉素-3’-磷酸转移酶基因(neomycin-3-'phosphotransferasegene) pCaMV35S:花椰菜花叶病毒35S启动子(35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus) pFMV35S:玄参花叶病毒35S启动子(35Spromoterfromamodifiedfigwortmosaicvirus) tE9:源于豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因终止子(terminatorofribulose-1,5-bisphosphatecarboxyl- aseE9genefrompea) tNOS:源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(terminatorofnopalinesynthasegenefrom Agrobacteriumtumefacien) 1SN/T5406—2021 以正式出版文本为准4 方法提要 采用特异性的方法对食用植物油中基因组DNA进行富集、提取和纯化,使用脂溶性载体上的 DNA亲和配体特异性结合食用植物油中残留DNA,并形成配体-DNA复合物,该复合物被吸附柱内吸 附膜上的亲和配基捕捉,利用工具酶A切除脂溶性载体并释放富集的DNA,经释放的DNA经微量离 心柱浓缩和纯化;采用实时荧光PCR技术扩增食用植物油中基因组DNA特异性的内源基因和外源基 因片段,并根据检测结果判断样品的核酸中是否含有转基因成分。 5 试剂和材料 除另有规定外,实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格,所有试剂均为分析纯或生化试剂。 5.1 异丙醇。 5.2 无水乙醇。 5.3 食用植物油DNA提取试剂1):见附录A。 1) 重鼎ZD-TG-39-15食用植物油DNA提取试剂盒是适合的市售产品实例。给出这一信息是为了方便本文件的 使用者。如果采用其他产品提取食用植物油中植物基因组DNA,经本文件规定的荧光PCR检测可以得到相 同或更好的检测效果,经实验评估后可以使用这些等效产品。5.4 TaqMan实时荧光PCR预混液:TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、氯化镁、dNTPs(含dATP、 dUTP、dCTP、dGTP))和UNG酶按比例配制的溶液。 5.5 引物和探针:按照表1选择靶标基因,靶标基因的引物探针序列见附录B。 表1 进口食用植物油转基因成分检测的靶标基因 植物油种类 内源基因 外源基因 大豆油 Lectin pCaMV35S、tNOS、CTP2-CP4-EPSPS 菜籽油 CruA pCaMV35S、pFMV35S、GOX、tE9 棉籽油 adhC pCaMV35S、tNOS、nptII 玉米油 hmgA pCaMV35S、tNOS、nptII、bar 6 仪器和耗材 6.1 离心机:离心力≥12000×g,转子适配50mL离心管和1.5mL离心管。 6.2 涡旋混匀仪。 6.3 恒温干燥箱/培养箱:53℃±1℃。 6.4 实时荧光PCR仪。 6.5 生物安全柜。 6.6 超低温冰箱:-70℃±1℃。 6.7 单道移液器:2μL~20μL,10μL~100μL,50μL~200L,100μL~1000μL,500μL~5000μL。 6.8 无菌离心管:50mL、1.5mL、0.5mL和0.2mL。 2SN/T5406—2021 以正式出版文本为准7 试样制备 按照GB/T19495.7制备的实验室样品进行试样制备。实验室样品体积≥1000mL,充分混匀,移 取100mL用于植物基因组DNA提取纯化。凝固或流动性较差的样品,加热至35℃~40℃,待样品 全部溶解混匀后再取样。 8 植物基因组DNA的提取纯化 8.1 在100mL试样中加入200μLDNA结合液,涡旋混匀后分次将全部液体转移至套有50mL收集 管的maxi吸附柱中并以5000×g离心2min,每次移取试样体积不超过15mL,每次离心后取出maxi 吸附柱、弃去收集管中离心过滤的油液并将maxi吸附柱重新套回收集管。 8.2 全部试样过滤完成后,向maxi吸附柱中加入5mL异丙醇并以5000×g离心5min。弃去收集管 中的离心滤液并将maxi吸附柱重新套回收集管。重复本步骤一次。 8.3 将吸附柱套在新的50mL收集管中,在53℃恒温干燥箱中敞口直立静置10min除去残余的异 丙醇。 8.4 按照每个试样添加溶液UT600μL和工具酶A20μL,在1.5mL离心管中加入适量的溶液UT 和工具酶A,配制酶消化液,并涡旋混匀后在53℃恒温干燥箱/培养箱预热3min。 8.5 向maxi吸附柱的膜中央位置移入预热的酶消化液,旋紧收集管盖后直立静置孵育30min。孵育 结束后以5000×g离心5min,弃去maxi吸附柱。 8.6 将收集管中离心过滤的液体移入新的1.5mL离心管中,加入60μL溶液AC,颠倒混匀,再加入 660μL异丙醇,再次颠倒混匀,静置15min。以≥12000×g离心10min。 8.7 小心弃去全部上清液,向管底加入200μL溶液BJ,静置5min后用枪头轻柔地吹打润洗管内壁离 心沉淀部位数次,涡旋混匀管内液体,再加入100μL无水乙醇涡旋混匀。 8.8 将全部液体移入套有1.5mL收集管的微量离心柱中,以12000×g离心2min。检查微量离心 柱,如有残余液体应增加离心时间使全部液体离心过滤。 8.9 弃去收集管中离心过滤的液体并将微量离心柱重新套回收集管中,向微量离心柱的膜中央位置移 入200μL溶液W2,以12000×g离心1min,弃去收集管中离心过滤的液体。再次按照前述方法用溶 液W2洗涤过滤。再次弃去收集管中离心过滤的液体后,以12000×g离心2min甩干残余的液体。 8.10 将微量离心柱套在新的1.5mL离心管中,向微量离心柱的膜中央位置移入20μL溶液TE,静置 3min,以12000×g离心2min,得到DNA提取物。 8.11 DNA提取物贮4℃备用,有效期为14d。 9 实时荧光PCR 9.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 9.1.1 阴性对照:内源基因的阴性对照为其他植物物种的基因组DNA,外源基因的阴性对照为非转基 因同一植物物种的基因组DNA。 9.1.2 阳性对照:含有靶标基因的植物基因组DNA或人工合成的质粒DNA。 9.1.3 空白对照:包括DNA提取时的提取空白对照(以水代替样品),以及PCR反应时的试剂空白对 照(以水代替DNA模板)。 3SN/T5406—2021 以正式出版文本为准9.2 反应体系 反应体系配制见表2。每个样品设置2个平行。 表2 荧光PCR反应体系 试剂名称 工作液浓度 反应体系终浓度 10×PCR缓冲液(不含氯化镁) 10× 1× 氯化镁溶液 25mmo