以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0 .0 1 C C S B1 6 3 中华人民共和国检验检疫行业标准 S N/T5 3 9 2—2 0 2 1 苹果牛眼果腐病菌检疫鉴定方法 D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f N e ofa b r a e a m a l i c o r t i c i s ,N e ofa b r a e a pe r e n n a n s , N e ofa b r a e a v aga b u n d a ,N e ofa b r a e a k i e n h o l z i i 2 0 2 1-0 6-1 8发布 2 0 2 2-0 1-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国广州海关 、中华人民共和国上海海关 、中华人民共和国黄埔海关 、 中国检验检疫科学研究院 。 本文件主要起草人 :王卫芳、易建平、魏霜、林慧娇、吕文刚、吴品珊。 ⅠS N/T5 3 9 2—2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准苹果牛眼果腐病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定方法 。 本文件适用于进境苹果和梨等寄主果实 、植株中苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件比不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 S N/T 2 4 5 5 进出境水果检验检疫规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 苹果牛眼果腐病菌的基本信息 4.1 病菌种类 4.1.1 腐皮明孢盘菌 学名:N e ofa b r a e a ma l i c o r t i c i s (C o r d l ey) H. S. J a c k s . (1 9 1 3) ;异名:P e z i c u l a ma l i c o r t i c i s (H. S. J a c k s .) N a n n f .(1 9 3 2) (苹果树炭疽病菌 ) ;无性型:C ry pt o spo r i ops i s c u r v i spo r a(P e c k) G r e mm e n (1 9 5 9) 。 4.1.2 多年生明孢盘菌 学名:N e ofa b r a e a pe r e n n a n s K i e n h o l z (1 9 3 9) ;无性型:C ry pt o spo r i ops i s pe r e n n a n s (Z e l l e r & C h i l d s) Wo l l e n w. (1 9 3 9) 。 4.1.3 白明孢盘菌 学名:N e ofa b r a e a v aga b u n d a (D e s m.) R o s s m a n (2 0 1 4) ;异名:N e ofa b r a e a a l b a(E. J . G u t h r i e) V e r k l ey (1 9 9 9) ;无性型:P h lyc t e m a v aga b u n d a D e s m.(1 8 4 7) 。 4.1.4 金氏明孢盘菌 学名:N e ofa b r a e a k i e n h o l z i i (S e i f e r t, Spo t t s & L é v e squ e) Spo t t s, L é v e squ e & S e i f e r t(2 0 1 3) ;无 性型:C ry pt o spo r i ops i s k i e n h o l z i i S e i f e r t, Spo t t s & L é v e squ e(2 0 1 0) 。 4.2 分类地位 真菌界(F u ngi) ,子囊菌门 (A s c o myc o t a) ,盘菌亚门 (P e z i z o myc o t i n a) ,锤舌菌纲 (L e o t i o m yc e t e s) , 1S N/T5 3 9 2—2 0 2 1以正式出版文本为准锤舌菌亚纲 (L e o t i o m yc e t i d a e) ,柔膜菌目 (H e l o t i a l e s ) ,皮盘菌科 (D e r m a t a c e a e ) ,明孢盘菌属 (N e ofa b - r a e a) 。 上述四种苹果牛眼果腐病菌的寄主范围 、地理分布 、侵染传播 、症状特点等信息参见附录 A。 5 方法原理 苹果牛眼果腐病菌的为害症状 、病菌的形态特征与培养性状 、实时荧光 P C R检测结果是制定本标 准的主要依据 。 6 仪器和设备 6.1 仪器 生物显微镜 、解剖镜、超净工作台 、生物培养箱 、电子天平 (感量0. 0 1 g) 、烘箱、灭菌锅、冰箱、恒温孵 育仪、制冰机、纯水仪、微波炉、电磁炉、微量移液器 (可调式范围 :0. 5 μL~1 0 0 0 μL) 、台式高速离心机 、 漩涡振荡器 、荧光P C R仪、核酸蛋白分析仪 。 6.2 设备 样品袋、保鲜袋、标签、定性滤纸 、放大镜、镊子、解剖刀、棉纱、脱脂棉、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种 针、培养皿(直径9 c m) 、烧杯、三角瓶、试管、量筒、研钵及研杵 、离心管(0. 2 mL,1. 5 mL,2 mL)及T ip 头(0. 1 μL~1 0 μL,5 μL~2 0 0 μL,1 0 0 μL~1 0 0 0 μL) 。 7 试剂和材料 7.1 试剂 除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 。 无菌双蒸水 、无水乙醇 、7 0%乙醇、2% C TA B提取缓冲液 、1 0% S D S 溶液、苯酚、三氯甲烷 、异戊 醇、异丙醇、T r i s - HC l 、DNA提取试剂盒 、实时荧光 P C R通用试剂 ,引物和探针 。 7.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (P DA) :每1 0 0 0 mL P DA 由2 0 0 g去皮马铃薯 、2 0 g葡萄糖、1 8 g琼脂配 制而成,1 2 1 ℃高压灭菌 2 0 m i n。 7.3 水果果实 苹果及梨果实 。 8 检疫鉴定方法 8.1 口岸现场查验 8.1.1 抽样 口岸现场查验时 ,按照S N/T 2 4 5 5进行抽样与取样 。 2S N/T5 3 9 2—2 0 2 1以正式出版文本为准8.1.2 果实症状检查 重点查看果实表面 、果梗凹部 、果萼凹部是否有似牛眼形状的腐烂病斑 ,用放大镜观察腐烂组织表 面是否有稀疏的菌丝体及奶油色胶质状子实体 (分生孢子盘 ) [症状特点参见 A. 4. 1和图B. 1 a)~c) ] 。 8.1.3 枝条症状检查 重点查看新梢或枝条 、幼树的大枝和主干是否有变色或溃疡病斑 ,溃疡病斑是否脱落并外露木质 部,病健交界树皮组织是否有裂纹 ,裂纹处是否有子实体 (分生孢子盘和子囊盘 ) [症状特点参见 A. 4. 2 和图B. 1 f)~j) ] 。 将可疑样品带回实验室进一步检验 ,记录样品品种 、数量、来源国及取样地点 、取样人和取样日期等 信息。 8.2 实验室检验 8.2.1 直接检验 肉眼观察或镜检病果的外观及剖面症状特点或果树的病梢病枝症状特点 ,记录病斑的形状 、大小、 质地及颜色 ,挑取病部子实体制成玻片 ,置于生物显微镜下 ,按8. 2. 3进行病菌的分离培养 ,按8. 2. 4观 察病菌的形态特征 。 8.2.2 保湿培养 如果病果或病枝梢上有明显病状但未形成明显的子实体 ,进行保湿培养 。将可疑病果或病枝梢置 于塑料盒或塑料袋中 ,于2 0 ℃下保湿培养 ,观察症状的变化 ,按8. 2. 3进行病菌分离培养 。 8.2.3 分离培养 采用组织分离培养法 ,用7 0%酒精对发病部位及周围组织表面进行喷雾消毒 ,风干后用消毒过的 刀片切取病健交界处果肉组织 ,切成5 mm×5 mm小块后放置于 A P DA平板中,或直接挑取病部的子 实体,置于A P DA平板上在 2 0 ℃、黑暗下培养 。菌落长出后 ,挑取菌落边缘的菌丝体 ,转至P DA平板 上纯化培养 ,纯菌株再转至 P DA平板,备用。 8.2.4 病菌培养性状和无性型形态特征观察 从纯菌株菌落边缘取直径 4 mm菌丝体块 ,置于P DA平板中央 ,在2 0 ℃、黑暗条件下培养 ,观察记 录菌落的生长速度 、颜色变化 、子实体的形成和产孢情况 。挑取P DA平板上的子实体制成玻片 ,置于 生物显微镜下观察 ,拍摄分生孢子盘 、分生孢子梗 、产孢细胞和分生孢子的形态特征 。每个菌株测量 3 0 个分生孢子 。 8.2.5 有性型形