以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0 .0 1 C C SB1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 3 9 1—2 0 2 1 苹果溃疡病菌检疫鉴定方法 D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f L e u c o s t o m a c i n c t a (F r .:F r .) H o h n 2 0 2 1-0 6-1 8发布 2 0 2 2-0 1-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国宁波海关 、中华人民共和国青岛海关 、中国科学院微生物研究所 、 中国检验检疫科学研究院 。 本文件主要起草人 :段维军、王英超、郭立新、蔡磊、刘芳、赵鹏、张慧丽、李雪莲、陈先锋、张永江。 ⅠS N/T5 3 9 1—2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准苹果溃疡病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了植物检疫中苹果溃疡病菌 [L e u c o s t o m a c i n c t a(F r .:F r .) H o h n.]的检疫鉴定方法 。 本文件适用于进境苹果及相关植物产品携带的苹果溃疡病菌的检疫鉴定 。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件 。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 基本信息 中文名:苹果溃疡病菌 。 学名:L e u c o s t o m a c i n c t a(F r .:F r .) H o h n.。 分类地位 :苹果溃疡病菌属真菌界 F u ngi、子囊菌门 A s c o myc o t a、粪壳菌纲 S o r d a r i o m yc e t e s、间座 壳菌目D i apo r t h a l e s 、黑腐皮壳菌科 V a l s a c e a e 、白座壳属 L e u c o s t o m a 。 近似种:核果黑腐皮壳菌 L e u c o s t o m a pe r s o o n i i (N i t s c h k e ) H ö h n等。 5 鉴定原理 根据苹果溃疡病菌在寄主上的症状特点 、培养及形态特征 (参见附录 A) 、I T S序列特征作为鉴定 依据。 6 检测流程 检测流程见图 1。 1S N/T5 3 9 1—2 0 2 1以正式出版文本为准 图1 检测流程 7 仪器和用具 7.1 仪器 显微镜、光照生物培养箱 、高压灭菌器 、超净工作台 、组织破碎仪 、恒温水浴锅 、台式冷冻离心机 、微 量分光光度仪 、电子天平 、超纯水仪 、漩涡振荡器 、冰箱、微量移液器 (0. 5 μL、2. 5 μL、1 0 μL、2 0 μL、 2 0 0 μL、1 0 0 0 μL) 、常规P C R仪、核酸电泳仪 、凝胶成像系统 、DNA提取仪。 7.2 用具 滤纸、手持放大镜 、培养皿、烧杯、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯。 8 试剂和培养基 8.1 试剂 购置如下试剂或者相应的试剂盒 :乙二胺四乙酸钠盐 (N a2E DTA·2H2O) 、氢氧化钠 (N a OH) 、 T r i s碱、浓盐酸(HC l) 、溴化十六烷基三甲铵 (C TA B) 、氯化钠(N a C l) 、聚乙烯吡咯烷酮 (P V P) 、冰醋酸 (CH3COOH) 、蒸馏水、三氯甲烷 (CHC l 3) 、异戊醇(C5H1 2O) 、7 0%乙醇(C2H6O) 、次氯酸钠 (N a C l O) 、 2%氢氧化钾 (KOH) 。 P C R和电泳检测所需试剂 :1 0×P C R 缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸 (d NT P s) 、T aq聚合酶、引物 (参见附录 B) 、超纯水、D L 2 0 0 0 M a r k e r、琼脂糖、G e l R e d 核酸凝胶染料 。 8.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (P DA) :马铃薯2 0 0 g,葡萄糖2 0 g,琼脂2 0 g,水1 0 0 0 mL。 9 鉴定方法 9.1 症状检查 观察有无苹果溃疡病菌的可疑症状 (参见附录 A) ,如流胶、溃疡、枝枯等。如发现可疑症状 ,取受害 部位进行分离培养 。 2S N/T5 3 9 1—2 0 2 1以正式出版文本为准9.2 分离培养 将坏死和健康交界处发病枝干剪成 1 mm2~2 mm2的小块,浸没在0. 5%次氯酸钠溶液中消毒 9 0 s后,无菌水冲洗 3次,灭菌滤纸吸干水分后放置在 P DA培养基上 ,将平皿放置在 1 8 ℃~2 0 ℃培养 箱中培养 。 分离纯化获得疑似菌株后 ,对菌株进行每天 1 6 h荧光(波长3 3 0 n m~4 0 0 n m)照射8 h黑暗处理 培养,5 d后每天观察记录菌落特征 ,并在显微镜下观察分生孢子等形态特征 。 9.3 直接观察 挑取发病枝条等部位 ,将病健交界处组织切成薄片后用 2%氢氧化钾液体煮沸 2 m i n~3 m i n,制片 在显微镜下观察子囊壳或分生孢子座等微观形态特征 。 9.4 菌丝体D N A制备 采用基因组提取试剂盒制备 DNA,或采用改良的 C TA B提取法(参见附录 B) 。 9.5 序列扩增测序 利用通用引物对 I T S片段进行扩增测序 (按照附录 C) ,测定序列后 ,将序列在 G e n B a n k 数据库进 行比对,与G e n B a n k 数据库中苹果溃疡病菌 I T S片段序列相似性进行比对分析 。 9.6 致病性测定 选取纯培养菌落 ,用打孔器打菌饼 ,备用;选取健康苹果枝条 ,用灭菌手术刀在枝干表面刮皮制造 5 mm×2 mm左右大小的伤口 ,将打取菌饼菌丝面向下贴置在枝干上 ,用灭菌水浸湿脱脂棉敷于其上 , 以无菌菌饼为对照 ,将接种枝干套置塑料袋进行 4 8 h保湿后,放置在2 5 ℃温室条件下培养 ,接种后每 天观察一次发病情况 。 致病性测定仅在首次检出时进行 ,常规检出可不进行致病性测定 。 1 0 形态学鉴定特征 1 0.1 菌落特征 苹果溃疡病菌在 P DA培养基上生长菌落边缘不规则 ,培养初期菌落白色 ,培养1周~2周后,菌落 颜色由白色转为浅黄色或橄榄色 ,底部颜色不均匀 。近似种核果黑腐皮壳菌 L e u c o s t o m a pe r s o o n i i 在 P DA培养基上培养 1周~2周后,菌落颜色通常由白色变为褐色或黑色 。 1 0.2 形态学特征 分生孢子座可在培养基上产生 ,黑色,很少单独存在 ,直径(1~3)mm。分生孢子形态简单 ,透明, 肾形至椭圆形 ,大小(1 μm~2 μm)×(5 μm~7 μm) 。 子囊壳难以培养获得 ,直径(2 0 0 μm~3 5 0 μm) ,子囊棍棒状 ,大小(7 μm~1 2 μm)×(1 4 μm~ 7 0 μm) ,内含8个子囊孢子 ,大小(2 μm~3 μm) ×(1 4 μm~2 2 μm) 。 1 0.3 致病性测定 接种的枝干产生 9. 1中描述的症状 。 3S N/T5 3 9 1—2 0 2 1以正式出版文本为准1 1 结果判定 疑似分离物的菌落和形态特征与 1 0. 1和1 0. 2相符,且I T S序列与G e n B a n k 中苹果溃疡病菌 I T S 序列相似性大于 9 9%,判定为检出苹果溃疡病菌 L e u c o s t o m a c i n c t a(F r .:F r .) H o h n。 否则判定未检出苹果溃疡病菌 。 实验室首次检出时需进行致病性测定工作 。 1 2 菌种保藏 将菌株转接在 P DA斜面上培养 ,待菌丝体长满斜面后 ,置于4 ℃下保存,并定期(1 8 0 d)转管,标注 分离物来源 、寄主、分离时间 、鉴定人。 1 3 检验资料的保存 妥善保存检验报告包括症状 、病菌、形态特征宏观以及微观图像等图文资料 ,以备复验 、谈判和仲 裁。检验报告必须注明检验日期 、方法、结果等,并有检验人签名 。 4S N/T5 3 9 1—2 0 2 1