以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0 .0 1 C C SB1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 3 8 7—2 0 2 1 莴苣花叶病毒检疫鉴定方法 D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f L e t t u c e m o s a i c v i r u s 2 0 2 1-0 6-1 8发布 2 0 2 2-0 1-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准 1 2 0 2—7 8 3 5 T/N S 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 莴苣花叶病毒检疫鉴定方法 S N/T 5 3 8 7—2 0 2 1 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1号(1 0 0 0 2 3) 编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 0 9 网址 www. c u s t o m s k b. c o m /b o o k 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8 8 0×1 2 3 0 1 /1 6 印张1 字数2 5千字 2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷 印数 1—5 0 0 * 书号: 1 5 5 1 7 5·6 7 9 定价1 6.0 0元以正式出版文本为准前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中国检验检疫科学研究院 、兰州海关技术中心 、中华人民共和国吴江海关 、福建省 农业科学院果树研究所 。 本文件主要起草人 :张永江、文朝慧、黄洁芳、谢丽雪、向均。 ⅠS N/T5 3 8 7—2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准莴苣花叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了莴苣花叶病毒的检疫鉴定方法 。 本文件适用于莴苣种子 、莴苣、豌豆、鹰嘴豆等寄主植株上莴苣花叶病毒的检疫鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 S N/T 2 1 2 2 进出境植物及植物 产品检疫抽样 S N/T 3 4 5 7 植物病毒分子生物学检测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 反转录重组酶聚合酶扩增 r e v e r s e t r a n s c r ipt i o n r e c o m b i n a s e po lym e r a s e a mpl i f i c a t i o n ;R T - R P A 一项等温扩增技术 。R P A是在单链 DNA结合蛋白 (s i ngl e - s t r a n d e d DNA b i n d i ng pr o t e i n, S S B) 的作用下 ,使模板DNA解链,并在DNA聚合酶的作用下 ,引物与模板正确配对形成复合体 ,然后DNA 聚合酶延伸引物生成新的 DNA互补链,实现对DNA的特定区域进行指数扩增 。RT - R P A 以样品 RNA为模板,先反转录成 c DNA,然后再以 c DNA为模板,进行R P A扩增。 4 莴苣花叶病毒基本信息 学名:L e t t u c e m o s a i c v i r u s 缩写:LMV 分类地位 :马铃薯Y病毒科(P o tyv i r i d a e) ,马铃薯Y病毒属(P o tyv i r u s) 。 传播途径 :汁液易于传毒 ;莴苣、昆诺阿藜种子传毒率 3%~1 3% ;可通过蚜虫传播侵染豌豆 ,但豌 豆种子不传毒 。 莴苣花叶病毒的其他信息参见附录 A。 5 方法原理 LMV的免疫原性和基因组特征是该病毒鉴定的依据 。依据LMV与抗体间的特异性反应 ,对样品 进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定 (DA S - E L I S A )和免疫试纸条检测 ;依据LMV的基因组特征建立 RT - P C R 和反转录重组酶聚合酶扩增技术 (RT - R P A )检测方法 ;通过这些方法的有效组合 ,判断样品是 1S N/T5 3 8 7—2 0 2 1以正式出版文本为准否带有LMV。 6 仪器设备 、用具及试剂 6.1 仪器设备 电子天平 (1/1 0 0 0 g) 、小型离心机 、恒温水浴锅 、酶标仪、台式冷冻机 、P C R仪、电泳仪、凝胶成像系 统、金属浴、制冰机、常规冰箱 、超低温冰箱 、涡旋振荡器等 。 6.2 用具 可调移液器 (0. 1 μL~2. 5 μL,2 μL~2 0 μL,1 0 μL~1 0 0 μL,2 0 μL~2 0 0 μL,1 0 0 μL~1 0 0 0 μL) 和可调移液器头 (1 0 μL,2 0 μL,1 0 0 μL,2 0 0 μL,1 0 0 0 μL) ,研钵,微型磨杵 。 6.3 试剂 试验用水应符合 G B/T 6 6 8 2的要求。 双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂符合附录 B要求,RT - P C R 试剂符合附录 D要求,RT - R P A 符 合附录E要求。 7 样品制备 7.1 莴苣种子 莴苣种子用 5倍~1 0倍体积(mL)抽提缓冲液研磨后 ,3 0 0 0g离心取上清 ,进行DA S - E L I S A 和免 疫试纸条检测 ,种子取样量按照 S N/T 2 1 2 2进行;另取3 5 0 μL上清液提取核酸或用种子直接提取核酸 后进行RT - P C R 和RT - R P A 检测。 7.2 植物样品 有症状植株 (叶片花叶 、植株矮化 ) ,每株单独编号并采集症状部位制样 ;无症状植株 ,5株为一组编 号并混合制样 ,按照S N/T 3 4 5 7进行。按1 g样品加入 5 mL~1 0 mL抽提缓冲液进行研磨 ,3 0 0 0g离 心取上清 ,进行DA S - E L I S A 和免疫试纸条检测 ;或提取核酸后进行 RT - P C R 和RT - R P A 检测。 8 检疫鉴定方法 8.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定 (D A S - E L I S A ) 把制备的样品上清液加入已包被 LMV抗体的酶联板中 ,进行DA S - E L I S A 检测。每个样品平行 加到两个孔中 。健康的植物组织作为阴性对照 ,感染LMV的植物组织作为阳性对照 ,样品提取缓冲液 作为空白对照 ;其中阴性对照的植物种类和材料 (如叶片)应尽量与检测样品相一致 。 具体操作按照附录 B执行。 8.2 免疫层析试纸条检测 免疫层析试纸条检测的对照设置见 8. 1,具体操作按照附录 C执行。 8.3 R T - P C R 检测 RT - P C R 检测阴性和阳性对照设置见 8. 1,灭菌双蒸水 (d d H 2O)作为空白对照 。分别提取样品和 2S N/T5 3 8 7—2 0 2 1以正式出版文本为准对照总RNA,反转录合成 c DNA后进行P C R检测,具体操作按照附录 D执行。如采用商品化一步法 试剂盒,则按照试剂盒说明进行 。 8.4 R T - R P A 检测 RT - R P A 检测阴性和阳性对照设置见 8. 1,灭菌双蒸水 (d d H 2O)作为空白对照 。分别提取样品和 对照总RNA,进行RT - R P A 检测,具体操作按照附录 E执行。如采用商品化试剂盒 ,则按照试剂盒说 明进行。 9 结果判定 样品经DA S - E L I S A 、试纸条、RT - P C R 或RT - R P A 中任一方法的检测 ,结果为阴性 ,判定样品不带 有莴苣花叶病毒 。 样品经DA S - E L I S A 或试纸条检测结果为阳性 ,还需用RT - P C R 或RT - R P A 进行检测 。分子生物 学检测结果为阴性 ,判定待检样品不带有莴苣花叶病毒 ;分子生物学检测结果为阳性 ,则判定样品带有 莴苣花叶病毒 。 1 0 结果记录与样品保存 1 0.1 结果记录 记录包括样品来源 、种类、检测时间 、地点、方法和结果 、检测人员签字 。DA S - E L I S A 检测应有酶 联反应数值 ;免疫层析试纸条检测应有试纸条检测图片 ;RT - P C R 和RT - R P A 检测应有电泳图片 。 1 0.2 样品保存 阳性样品直接放于 -8 0 ℃冰箱或冷冻干燥后放于 -8 0 ℃冰箱保存 1年,保存的样品要做好标记和 登记工作 ,以备复验 、谈判和仲裁 。保存期满后 ,需经灭活处理 。 3S N/T5 3 8 7—2 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A (资料性) 莴苣花叶病毒其他信息 A.1 寄主范围 自然寄主包括莴苣 (L a c t u c a s a t i v a) 、豌豆(P i s u m s a t i v u m ) 、苣荬菜(S o n c h u s b r a c hyo t u s) 、鹰嘴豆 (C i c e r a r i e t i n u m