以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0 .0 1 C C SB1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 3 8 6—2 0 2 1 葡萄灰皮诺病毒检疫鉴定方法 D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f G r ape v i n e P i n o t gr i s v i r u s 2 0 2 1-0 6-1 8发布 2 0 2 2-0 1-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国北京海关 、北京爱普拜生物技术有限公司 、中国检验检疫科学研 究院。 本文件主要起草人 :邓丛良、赵晓丽、向军、郑祖亮、刘兴亮、郑春生、吕玉峰。 ⅠS N/T5 3 8 6—2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准葡萄灰皮诺病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了葡萄灰皮诺病毒的检疫鉴定方法 。 本文件适用于可能带有葡萄灰皮诺病毒的葡萄苗木 、接穗及其产品的检疫鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 微滴式数字 P C R d r opl e t d igi t a l P C R 一种核酸单分子扩增技术 ,基于扩增前将混匀的 P C R反应液被微滴发生器分成数万个单独的微反 应,核酸分子分布在不同的微反应中 ,独立进行单分子 P C R扩增,降低了可能存在的竞争 ,待荧光P C R 反应结束后 ,逐一检查每个微滴是否有扩增发生 ,就可以精确测得待测 DNA或RNA模板的分子数 。 注: 不同于常规 P C R和实时荧光 P C R技术,该技术不需要制作标准曲线 ,也与待测分子 P C R扩增效率无关 ,可以 直接测出样品中待测核酸模板的绝对数目 ,实现了DNA或RNA的绝对定量 。 4 葡萄灰皮诺病毒基本信息 学名:G r ape v i n e P i n o t gr i s v i r u s。 缩写:G P GV。 分类地位 :线形病毒科 (B e t a f l e x i v i r i d a e ) ,纤毛病毒属 (T r i c h o v i r u s ) 。 传播途径 :主要通过嫁接传播和机械传播 。 葡萄灰皮诺病毒的其他信息参见附录 A。 5 方法原理 根据该病毒基因组特异性进行普通 RT - P C R 、实时荧光 RT - P C R 和数字RT - P C R 检测,通过电泳 条带大小 、扩增曲线 、产生微滴的变化和基因组序列进行结果判定 。 1S N/T5 3 8 6—2 0 2 1以正式出版文本为准6 仪器设备和试剂 6.1 仪器设备和用具 电子天平 (感量0. 0 0 1 g) 、普通天平 (感量0. 1 g) 、高速冷冻离心机 、超低温冰箱 (-8 0 ℃) 、凝胶成 像系统、P C R仪、实时荧光 P C R仪、数字P C R检测系统 (微滴发生器 、封膜仪、普通P C R仪和微滴荧光 检测器) 、核酸定量仪 、可调移液器 (2. 5 μL,1 0 μL,2 0 μL,2 0 0 μL,1 0 0 0 μL) 、无RNA酶吸头(1 0 μL, 2 0 μL,2 0 0 μL,1 0 0 0 μL) 、无RNA酶离心管 、P C R反应管(2 0 0 μL) 、实时荧光 9 6孔反应板 、数字P C R 微反应体系生成联排管 、9 6孔荧光定量 P C R反应板和封膜 。 6.2 试剂 除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 ,实验用水应符合 G B/T 6 6 8 2中相关规定 。 普通RT - P C R 检测试剂应符合附录 B要求;实时荧光 RT - P C R 检测试剂应符合附录 C要求;数字 RT - P C R 检测试剂应符合附录 D要求。 7 检疫鉴定 7.1 检测样品的制备 苗木及接穗 :有症状(节间缩短 ,叶片出现变色 、卷叶和坏死症状 )的苗木及接穗单独编号 ,每株采集 症状嫩叶片 5 g用于后续检测 ;无症状的植株每 1 0株分为1组编号,混合采集植株嫩叶 1 0 g用于后续 检测。 植物产品 (果实) :有坏死症状的葡萄果粒单独采样用于后续检测 ,无症状的葡萄果粒每 5穗分为 1组编号,每穗取4果粒,总计取2 0用于后续检测 。 7.2 普通R T - P C R 方法 提取样品总 RNA,设置阳性对照 、阴性对照和空白对照 ,进行普通 RT - P C R 检测,具体操作步骤按 照附录B执行。 7.3 实时荧光 R T - P C R 方法 提取样品总 RNA,设置阳性对照 、阴性对照和空白对照 ,进行实时荧光 RT - P C R 检测,具体操作步 骤按照附录 C执行。 7.4 数字R T - P C R 方法 提取样品总 RNA,设置阳性对照 、阴性对照和空白对照 ,进行数字荧光 RT - P C R 检测,具体操作步 骤按照附录 D执行。 8 结果判定 同时符合普通 RT - P C R 检测和实时荧光 RT - P C R 检测结果为阳性 ,判定待检测样品携带葡萄灰皮 诺病毒。 同时符合普通 RT - P C R 检测和数字荧光 RT - P C R 检测结果为阳性 ,判定待检测样品携带葡萄灰皮 诺病毒。 2S N/T5 3 8 6—2 0 2 1以正式出版文本为准当普通RT - P C R 检测结果为阳性 ,则进行序列测定 ,测定序列经对比分析为葡萄灰皮诺病毒的 ,判 定待检测样品携带葡萄灰皮诺病毒 。 9 样品保存与结果记录 9.1 样品保存 检测结果判定为阳性的样品应妥善保存于 -8 0 ℃冰箱中,并做好登记和标记 ,以备复核用 。 9.2 结果记录 完整的实验记录要包括 :样品的来源 、种类、采集时间 、实验检测时间 、地点、方法和结果 ,并有实验 人员的签字 ;普通RT - P C R 检测结果保存电泳图片 ,测序保留序列对比结果 ;实时荧光 RT - P C R 检测结 果保存荧光曲线图及 C t值;数字RT - P C R 检测结果保存微滴生成图 。 3S N/T5 3 8 6—2 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A (资料性) 葡萄灰皮诺病毒相关资料 A.1 寄主范围 自然条件下侵染葡萄 (V i t i s v i n ife r a) 。 A.2 危害症状 寄主受G P GV侵染后,叶片出现变色 、卷叶和坏死症状 ,果实表面出现坏死斑点 ,如图A. 1所示。 说明: A、B、C、D— — —受侵染葡萄叶片症状 (A n n a i s a G i a mpe t r u z z i,2 0 1 2) ; E、F — — —受侵染葡萄果实症状 (C h o I S,2 0 1 3) 。 图A.1 G P G V侵染葡萄植株和果实的症状 4S N/T5 3 8 6—2 0 2 1