以正式出版文本为准I C S6 5.0 2 0 C C SB1 6 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 3 8 5—2 0 2 1 蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法 D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f B l u e b e r r y s c o r c h v i r u s 2 0 2 1-0 6-1 8发布 2 0 2 2-0 1-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法 S N/T 5 3 8 5—2 0 2 1 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1号(1 0 0 0 2 3) 编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 3 1 网址 www. c u s t o m s k b. c o m /b o o k 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8 8 0×1 2 3 0 1 /1 6 印张1 字数3 0千字 2 0 2 1年 月第一版 2 0 2 1年 月第一次印刷 印数 1—5 0 0 * 书号: 1 5 5 1 7 5·6 7 3 定价1 6.0 0元以正式出版文本为准前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国福州海关 、福建省农业科学院果树研究所 、中国农业科学院生物 技术研究所 、中国检验检疫科学研究院 、中华人民共和国厦门海关 、福建农林大学 。 本文件主要起草人 :沈建国、谢丽雪、陈细红、李韬、李为民、张永江、廖富荣、高芳銮、陈寿铃。 ⅠS N/T5 3 8 5—2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准蓝莓焦枯病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了蓝莓焦枯病毒的检疫鉴定方法 。 本文件适用于可能携带蓝莓焦枯病毒的蓝莓繁殖材料的检疫鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 S N/T 2 1 2 2 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 蓝莓焦枯病毒基本信息 中文名:蓝莓焦枯病毒 。 学名:B l u e b e r r y s c o r c h v i r u s,缩写:B l S c V。 分类地位 :乙型线状病毒科 (B e t a f l e x i v i r i d a e ) 、香石竹潜隐病毒属 (C a r l a v i r u s )成员。 蓝莓焦枯病毒的寄主范围 、病害症状 、分布地区 、传播途径 、粒体形态 、基因组等其他信息参见附 录A。 5 原理 蓝莓焦枯病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据 。 6 仪器设备 、用具及试剂 6.1 仪器设备 高速冷冻离心机 、电子天平 、酶标仪、P C R仪、荧光P C R仪、电泳仪、凝胶成像分析系统 、水平电泳 槽、常规冰箱 、超低温冰箱 、恒温水浴锅 、高压灭菌锅 、研磨仪等 。 6.2 用具 各种量程的可调移液器 (1 0 0 0 μL、2 0 0 μL、1 0 0 μL、2 0 μL、1 0 μL、2 μL) 、P C R反应管、无RN a s e离 心管(1. 5 mL) 、研钵、酶联板等 。 1S N/T5 3 8 5—2 0 2 1以正式出版文本为准6.3 试剂 除另有规定外 ,所有试剂均为分析纯 ,实验用水应符合 G B/T 6 6 8 2中相关规定 。双抗体夹心酶联 免疫吸附测定 (DA S - E L I S A )试剂应符合附录 B的规定、免疫层析试纸条试剂应符合附录 C的规定、巢 式RT - P C R 试剂应符合附录 D的规定、实时荧光 RT - P C R 试剂应符合附录 E的规定。 7 检测与鉴定 7.1 抽样检查 按照S N/T 2 1 2 2给出的方法进行抽样 、取样,尽量抽取有病毒危害症状的植物样品 ,B l S c V的危害 症状描述参见附录 A。 7.2 样品制备 称取0. 5 g~1. 0 g待测样品按 1∶1 0(质量∶体积,W/V)加入抽提缓冲液研磨 ,4 ℃下1 0 0 0 0 g离 心1 0 m i n,上清即为样品提取液 ,用于DA S - E L I S A 、免疫层析试纸条 、巢式RT - P C R 和实时荧光 RT - P C R检测。 7.3 D A S - E L I S A 具体方法按附录 B检测。 7.4 免疫层析试纸条 具体方法按附录 C检测。 7.5 巢式R T - P C R 具体方法按附录 D检测。 7.6 实时荧光 R T - P C R 具体方法按附录 E检测。 7.7 序列测定与比对 P C R产物纯化后 ,直接测序或者克隆测序 ,利用NC B I网站上的 B LA S T 软件把测序所得到的核苷 酸序列与已知 B l S c V序列进行比对 。 8 结果判定 样品检测时 ,检测结果判定按下述原则进行 。 — — —血清学检测 (DA S - E L I S A 或免疫层析试纸条 )初筛结果为阴性 ,且巢式RT - P C R 或实时荧光 RT - P C R 方法检测结果为阴性 ,则判定样品不携带 B l S c V。 — — —血清学检测 (DA S - E L I S A 或免疫层析试纸条 )初筛结果为阳性 ,则采用巢式 RT - P C R 或实时 荧光RT - P C R 方法进行验证 。若验证结果为阳性 ,则判定样品携带 B l S c V;若验证结果为阴 性,则判定样品不携带 B l S c V。 — — —巢式RT - P C R 检测结果为阳性 ,且测定的序列为 B l S c V序列,则判定样品携带 B l S c V。 — — —巢式RT - P C R 检测结果为阳性 ,且实时荧光 RT - P C R 检测结果为阳性 ,则判定样品携带 2S N/T5 3 8 5—2 0 2 1以正式出版文本为准B l S c V。 9 结果记录与样品保存 9.1 结果记录 记录好各项实验数据 ,包括样品来源 、种类、时间,实验的时间 、地点、方法和结果等 ,并要有经手人 和实验人员的签字 。DA S - E L I S A 检测结果保留吸光值数据报告 ;免疫层析试纸条保留试纸条检测图 片;巢式RT - P C R 保留电泳照片 ;实时荧光 RT - P C R 保留实时荧光结果图片 ;序列测定保留电子文件 。 9.2 样品保存 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在 -2 0 ℃或-8 0 ℃冰箱中,并做好登记和标记工作 ,以 备复核用 。 3S N/T5 3 8 5—2 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A (资料性) 蓝莓焦枯病毒的背景资料 A.1 寄主范围 目前已报道的自然寄主仅为蓝莓 (V a c c i n i u m sp p.) 。 A.2 病害症状 受B l S c V侵染的大多数蓝莓品种在开花时期突然出现花和叶片枯萎症状 (图A. 1) ,症状严重时导 致果实小或不结果 ,但在少数蓝莓品种上呈隐症现象 。蓝莓感染 B l S c V后1年~2年出现症状 ,开始1 ~2个枝条,最后蔓延至全株发病 。 注:引自h t tp: / /www. w h a t c o m. w s u. e d u /ipm/b l u e/s c o r c h. h t m l 。 图A.1 B l S c V侵染蓝莓引起的症状 A.3 分布地区 主要分布于美国 、加拿大、荷兰、意大利、波兰等国家 。 A.4 传播途径 主要通过蚜虫介体以非持久性方式传播 。 A.5 粒体形态 病毒粒体呈线状 ,长约6 9 0 n m,直径约1 4 n m。 A.6 病毒基因组 正义单链 RNA病毒,基因组全长约 8. 5 k b。 4S N/T5 3 8 5—2 0 2 1