以正式出版文本为准I C S1 1.0 2 0 C C SC6 2 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/T5 3 7 1—2 0 2 1 国境口岸血吸虫 P C R和荧光P C R检测方法 D e t e c t i o n m e t h o d o f s c h i s t o s o m a by P C R a n d r e a l - t i m e f l u o r e s c e n c e P C R a t f r o n t i e r po r t s 2 0 2 1-0 6-1 8发布 2 0 2 2-0 1-0 1实施 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 国境口岸血吸虫 P C R和荧光P C R检测方法 S N/T 5 3 7 1—2 0 2 1 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1号(1 0 0 0 2 3) 编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 3 1 网址 www. c u s t o m s k b. c o m /b o o k 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8 8 0×1 2 3 0 1 /1 6 印张0. 7 5 字数2 2千字 2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷 印数 1—5 0 0 * 书号: 1 5 5 1 7 5·6 6 1 定价1 2.0 0元以正式出版文本为准前 言 本文件按照 G B/T 1. 1—2 0 2 0《 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 》的规 定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 :中华人民共和国成都海关 、中华人民共和国重庆海关 、中华人民共和国福州海关 。 本文件主要起草人 :田绿波、石莹、骆星丹、何纬、黄恩炯、樊学军、辛文瀚、王俊贤。 ⅠS N/T5 3 7 1—2 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准国境口岸血吸虫 P C R和荧光P C R检测方法 1 范围 本文件规定了国境口岸日本血吸虫 、埃及血吸虫 、曼氏血吸虫 P C R和三重实时荧光 P C R检测的对 象、检测方法 、生物安全及结果报告 。 本文件适用于国境口岸日本血吸虫 、埃及血吸虫 、曼氏血吸虫的实验室检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件 ;不注日期的引用文件 ,其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求 S N/T 1 1 9 3 基因检验实验室技术要求 WS/T 2 3 0 临床诊断中聚合酶链反应 (P C R)技术的应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 血吸虫 s c h i s t o s o m a 属于扁形动物门吸虫纲裂体吸虫科 ,也称裂体吸虫 。寄生于人体的有日本血吸虫 、埃及血吸虫和曼 氏血吸虫等 ,可引起血吸虫病 。其幼虫在中间宿主螺类体内发育 ,尾蚴通过皮肤 、粘膜进入人体内 ,可侵 及肺、胃肠道、泌尿和中枢神经系统 ,有些虫卵随血流进入各器官 ,引起各种症状 ,如肝肿大 ,严重时造成 宿主死亡 。日本血吸虫主要见于中国大陆 、日本、中国台湾 、东印度群岛和菲律宾 ;埃及血吸虫主要分布 于非洲、南欧和中东 ;曼氏血吸虫主要分布于非洲和南美洲北部 。血吸虫感染后会出现皮疹 、发热、腹 痛、腹泻、乏力、肝脏不适等症状 ,严重危害人类的健康 。日本血吸虫 、曼氏血吸虫成虫主要寄生于人体 肠系膜下静脉 ,埃及血吸虫成虫主要寄生于膀胱静脉丛 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 D E P C:焦碳酸乙二酯 (d i e t hyl p yr o c a r b o n a t e ) P AG E:聚丙烯酰胺凝胶电泳 (po lya c ryl a m i d e ge l e l e c t r oph o r e s i s) F AM:6 -羧基荧光素 (6 - c a r b o x yf l u o r e s c e i n ) BHQ:黑洞淬灭基团 (b l a c k h o l e qu e n c h e r ) 5 检测对象 5.1 国境口岸发现的有皮疹 、发热、腹痛、腹泻、乏力、肝脏不适等症状 ,疑似血吸虫感染病人 。 1S N/T5 3 7 1—2 0 2 1以正式出版文本为准5.2 来自血吸虫感染疫区人员 。 5.3 其他申请检验的人员 。 6 生物安全和 P C R防污染要求 实验室生物安全和运输要求应符合 G B 1 9 4 8 9的规定。P C R防污染措施按 S N/T 1 1 9 3和WS/T 2 3 0的规定执行 。 7 主要试剂 7.1 无RNA酶的D E P C水。 7.2 DNA 提取液(含0. 9% N a C l和0. 1% E DTA - N a 2的混合液 ) 。 7.3 引物应用液浓度配制成 2 0 μm o l/L,引物和探针见表 1。等效商品化试剂也可使用 。 表1 血吸虫P C R和实时荧光 P C R检测引物及探针 引物及探针名称 序列(5’- 3’ ) 扩增片段 日本血吸虫 P C R检测引物Sj- F 1 5 ’- GGTTATGGTTTGTTGATGTTAGG - 3’ Sj- R 1 5 ’- AC TAATT CAC T C T C GGAC T CAC C - 3’2 6 9 bp 曼氏血吸虫 P C R检测引物S m - F 1 5 ’- AGTTAC TRGGAAAGGTGAAAGTG C - 3’ S m - R 1 5 ’- CAC TAAAACAC T C C TTATAC C RGG - 3’3 5 0 bp 埃及血吸虫 P C R检测引物S h - F 1 5 ’- G C GGATGATTTT C GTTGTTAGG - 3’ S h - R 1 5 ’- TT CAGAC T C GGAATAGT CACATGG - 3’3 9 8 bp 日本血吸虫实时 荧光P C R检测引物Sj- F 5 ’- GGGGTTTGTATTATAAGTTTATGATGTT - 3’ Sj- R 5 ’- CACAC GAACAG CAC TAAT CAAT C - 3’ Sj- P5’- F AM - C CAAGAAC C T CAAC C TAACAT CAACAA - BHQ 1 - 3 ’1 2 5 bp 曼氏血吸虫实时荧光 P C R检测引物及探针S m - F 5 ’- AGTAAGTGAGAATAAT C GTAC G C C - 3’ S m - R 5 ’- GGAATAAACAT CATAG CATATT CACA - 3’ S m - P 5 ’- HE X - ACAC CAC T CACAAG C T CAC T C T - BHQ 1 - 3 ’1 3 5 bp 埃及血吸虫实时 荧光P C R检测引物S h - F 5 ’- GG CATGGTTAATAGTRTTATTAAGAGAG - 3’ S h - R 5 ’- GGAATAC T C G CAAG CAAATATAAC - 3’ S h - P5’- R e d 6 1 0 - AGTAAT C GTACAC CATGTGAC TATT C - BHQ 2 - 31 3 9 bp 注: 引物序列中的简并碱基 R表示G或A。 7.4 P C R基础试剂 :市售商品化试剂 。 7.5 电泳缓冲液 (1 0×T B E ) :称取1 0 8 g T r i s碱,7. 4 4 g N a2E DTA·H2O和5 5 g硼酸,溶于8 0 0 mL 的d d H 2O中,充分搅拌溶解后加水定容至 1 L,室温保存 。 7.6 G o l d e n V i e w 核酸染料 (或其他等效核酸染料 ) :使用浓度为 5 μL/5 0 mL。 2S N/T5 3 7 1—2 0 2 1以正式出版文本为准8 主要仪器 主要仪器设备如下 : — — —二级生物安全柜 ; — — —台式高速冷冻离心机 (最高离心力 1 2 0 0 0 g以上) ; — — —涡旋振荡器 ; — — —冰箱:4 ℃和-2 0 ℃; — — —超净工作台 ; — — —微型离心机 ; — — —P C R仪; — — —荧光定量 P C R仪; — — —凝胶成像分析系统 ; — — —电子天平 (d=1 mg) ; — — —微波炉; — — —电泳仪; — — —高压灭菌锅 ; — — —超纯水器或双蒸水器 ; — — —微量可调移液器一套 (含以下5种规格:1 0 μL、2 0 μL、1 0 0 μL、2 0 0 μL、1 mL) 。 9 样品采集与运输 9.1 样品采集 9.1.1 粪便标本 采集新鲜粪便于一次性无菌采便管内 ,成形便采集