ICS07.100.30 CCSX04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5364.2—2021 出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字PCR法 第2部分:霍乱弧菌 Droplet digital PCR method for detection of pathogens in export food— Part 2:Vibrio cholerae 2021-11-22发布 2022-06-01实施 中华人民共和国海关总署发布 以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 SN/T 5364—2021《出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字PCR法》共分为8个部分: 第1部分:副溶血性弧菌 第2部分:霍乱弧菌 第3部分:溶藻弧菌 第4部分:创伤弧菌 第5部分:金黄色葡萄球菌 第6部分:单核细胞增生李斯特氏菌 第7部分:产志贺毒素大肠埃希氏菌 第8部分:克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌) 本文件为SN/T 5364—2021的第2部分。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位: 中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国天津海关、中国检验检疫科学研 究院。 本文件主要起草人:魏海燕、马丹、魏咏新、李丹、张西萌、徐蕾蕊、刘莉、曹佳悦、曾静、董志珍、 邢仕歌、赵良娟、高飞。 ⅠSN/T5364.2—2021 以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字PCR法 第2部分:霍乱弧菌 1 范围 本文件规定了食品中总霍乱弧菌和含毒力基因霍乱弧菌的微滴式数字PCR检测方法。 本文件适用于食品中总霍乱弧菌和含毒力基因霍乱弧菌的快速定性检测。 本文件的检出限为1 CFU/25 g~5 CFU/25 g(或1 CFU/25 mL~5 CFU/25 mL)。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403—2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 SN/T 1022 进出口食品中霍乱弧菌检验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA(deoxyribonuleic acid):脱氧核糖核酸。 ddPCR(droplet digital polymerase chain reaction):微滴式数字PCR。 gbpA(GlcNAc-binding protein gene):N-乙酰葡糖胺结合蛋白A的编码基因。 PCR(polymerase chain reaction):聚合酶链式反应。 tcpA( toxin coregulated pilin gene):毒力协同调节菌毛编码基因。 5 方法原理 分别针对霍乱弧菌种属特异性gbpA基因及毒力基因tcpA设计引物/探针,将一定浓度的引物、 探针与模板DNA及数字PCR反应预混液混合,配成双重数字PCR反应体系。将该双重数字PCR体 系分布到10 000~20 000个微滴中,使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或0,然后进行PCR扩 增。gbpA基因及tcpA基因探针5’端分别标记FAM和VIC荧光基团,利用数字PCR系统的双通道 检测,可同时对两个基因的荧光信号进行采集分析。根据gbpA基因及tcpA基因所对应的阳性微滴 1SN/T5364.2—2021 以正式出版文本为准的有无判定样品中是否含有霍乱弧菌和含毒力基因的霍乱弧菌。 6 主要设备及耗材 6.1 天平:感量0.1 g。 6.2 均质器。 6.3 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 6.4 高速台式冷冻离心机(离心力12 000g)。 6.5 涡旋振荡仪。 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.7 生物安全柜。 6.8 ddPCR扩增仪及相关配套设备。 6.9 不同量程移液器:100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、10 μL~100 μL、0.5 μL~10 μL。 6.10 离心管:2 mL、1.5 mL和0.2 mL。 7 材料与试剂 7.1 仅使用分析纯试剂和符合GB/T 6682规定的一级水。 7.2 细菌基因组提取试剂盒。 7.3 ddPCR反应配套试剂。 7.4 去游离核酸酶:伯乐1)。 1) 给出这一信息是为了方便本文件使用者,并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使 用等效产品。7.5 阳性对照:霍乱弧菌参照菌株DNA,或含目的片段的DNA亦可。 7.6 霍乱弧菌N-乙酰葡糖胺结合蛋白A的编码基因(gbpA)序列片段参见附录A.1,引物探针如下: gbpA-F:5’-CAAACCAAACTGGAACCCAAA-3’; gbpA-R:5’-TCAACGACACAGAACGGATTG-3’; gbpA-P:5’-FAM-CCATTGTCGCGTGATGCATTTGACC-BHQ1-3’。 7.7 霍乱弧菌毒力协同调节菌毛编码基因(tcpA)序列片段参见附录A.2,引物探针如下: tcpA-F:5’-GGGATATGTTTCCATTTATCAACGT-3’; tcpA-R:5’-GCGACACTCGTTTCGAAATCA-3’; tcpA-P:5’-FAM-TGCTTTCGCTGCTGTCGCTGATCTT-BHQ1-3’。 8 检测程序 食品中霍乱弧菌ddPCR检测程序见图1。 2SN/T5364.2—2021 以正式出版文本为准图1 食品中霍乱弧菌ddPCR检测程序 9 实验操作步骤 9.1 样品制备 参照SN/T 1022中方法进行样品制备和第一次选择性增菌。 9.2 DNA提取 直接取9.1获得的增菌液2 mL加到无菌离心管中,8 000g离心2 min,尽量吸弃上清;利用 100 μL磷酸盐缓冲液重悬沉淀,加入20 μL去游离核酸酶,置于37 ℃作用15 min~30 min,95 ℃ 加热 10 min使酶失活。继而利用细菌基因组提取试剂盒提取DNA,操作方法按试剂盒说明书进行。 9.3 DNA浓度和纯度测定 取适量DNA原液加双蒸水稀释一定倍数后,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260 nm 和280 nm处的吸收值,按照式(1)计算DNA的浓度。 ρ=A260×N×50 …………………………( 1 ) 式中: ρ———DNA浓度,单位为微克每毫升(μg/mL) ; A260———260 nm处的吸光值; N———核酸稀释倍数。 当DNA浓度为0.1 μg/mL~100 μg/mL,A260/A280在1.8~2.0之间时,适用ddPCR检测。 3SN/T5364.2—2021 以正式出版文本为准9.4 ddPCR检测 9.4.1 对照和平行 检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以霍乱弧菌标准菌株DNA或含目的片段 的DNA作为阳性对照,利用细菌基因组提取试剂盒按步骤9.2提取的大肠埃希氏菌标准菌株DNA作 为阴性对照,用等体积的双蒸水代替DNA模板作为空白对照。每个待检样品提取的DNA溶液进行3 个平行ddPCR检测。 9.4.2 反应体系 按照表1配制反应体系。 表1 ddPCR反应体系 试剂名称 储备液浓度 终浓度 体积 数字PCR反应预混液 2× 1× 10 μL gbpA-F 10 μmol/L 0.75 μmol/L 1.5 μL gbpA-R 10 μmol/L 0.75 μmol/L 1.5 μL gbpA-P 10 μmol/L 0.25 μmol/L 0.5 μL tcpA-F 10 μmol/L 0.75 μmol/L 1.5 μL tcpA-R 10 μmol/L 0.75 μmol/L 1.5 μL tcpA-P 10 μmol/L 0.25 μmol/L 0.5 μL DNA模板 — — 3 μL 体系总体积 — — 20 μL 9.4.3 微滴生成 将配制好的数字PCR反应混合液,加入微滴生成装置加样孔中,按仪器操作说明生成微滴。 9.4.4 ddPCR扩增 将生成的微滴缓慢转移至96孔板中,封膜后置于PCR仪上,按以下参数进行PCR扩增:95 ℃ 10 min(升降温速度:1 ℃/s);94 ℃ 30 s(升降温速度:1 ℃/s), 60 ℃ 1 min(升降温速度:1 ℃/s),45个 循环;98 ℃ 10 min(升降温速度:1 ℃/s),4 ℃ 保存反应产物。 注: PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。 9.4.5 荧光信号读取 扩增反应结束后,将96孔板放入ddPCR检测仪中对每个微滴进行荧光检测,采用FAM和VIC通 道分别读取gbpA基因及tcpA基因扩增的荧光信号。 10 结果分析与表述 10.1 阈值的设定 根据空白对照的终点荧光值设定阈值限,阈值限应对空白和阳性扩增结果进行明确的区分。 4SN/T5364.2—2021 以正式出版文本