以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5334.7 —2020 转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 7 部分：转基因苜蓿 Protocol of digital PCR for quantitatively detecting genetically modified plants and their derived products — Part 7: Genetically modified alfalfa 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5334.7—2020前 言 SN/T 5334— 2020《转基因植物产品的数字 PCR 检测方法》分为 8 个部分： ——第 1 部分：通用要求及定义；——第 2 部分：转基因大豆；——第 3 部分：转基因玉米；——第 4 部分：转基因油菜；——第 5 部分：转基因棉花；——第 6 部分：转基因马铃薯； ——第 7 部分：转基因苜蓿； ——第 8 部分：转基因甜菜。本部分为 SN/T 5334— 2020 的第 7 部分。本文件按照 GB/T1.1— 2020 给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广州海关检验检疫技术中心。本文件主要起草人：刘津、付伟、高东微、刘二龙、朱水芳、董洁、关丽军、谢力。 I以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5334.7—2020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 7 部分：转基因苜蓿 1 范围 本文件规定了进、出口苜蓿中转基因品系特异性的数字 PCR（dPCR）定量检测方法。 本文件适用于苜蓿种子和苜蓿草中转基因苜蓿 J101、J163、KK179 品系特异性成分的定量检测。 本文件的定量检测低限为 7.0 拷贝 / μL，定性检测低限为 1.4 拷贝 / μL。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 SN/T 5334.1 转基因产品定量检测数字 PCR 方法 第 1 部分：通用要求及定义 3 术语和定义 SN/T 5334.1 界定的术语与定义适用于本文件。 4 方法原理 见 SN/T 5334.1。 5 设备及试剂 5.1 内源基因和外源基因：内标准基因为乙酰辅酶 A 羧化酶基因（ACC） ；外源序列为品系 J101、 J163 和 KK179 外源基因插入位点 5 ’端跨界序列。苜蓿中转基因品系特异性 dPCR 定量检测所用引物 探针序列参见附录 A。5.2 其他设备及试剂要求见 SN/T 5334.1 的规定。 6 方法操作步骤 6.1 一般性操作步骤 一般性操作步骤见 SN/T 5334.1 的规定。 6.2 数字 PCR 反应体系 按照表 1 配制数字 PCR 的最终反应体系。以正式出版文本为准2 SN/T 5334.7—2020表 1 数字 PCRa实验反应体系 试剂b储备液浓度 体积 终浓度 MasterMix 2× 10 μL 1× 内标准基因 -F 10 μmol/L 0.8 μL 0.4 μmol/L 内标准基因 -R 10 μmol/L 0.8μL 0.4 μmol/L 内标准基因 -P 10 μmol/L 0.4μL 0.2 μmol/L 外源基因 -F 10 μmol/L 0.8μL 0.4 μmol/L 外源基因 -R 10 μmol/L 0.8μL 0.4 μmol/L 外源基因 -P 10 μmol/L 0.4μL 0.2 μmol/L DNA 模板 — 2 — 水 — 补水至 20 μL — a ： 推荐使用市面上现售的数字 PCR 平台进行实验； b ： 最终反应体系中试剂添加的种类和总体系体积可能会根据不同的数字 PCR 平台产生差异。进行不同数字 PCR 平台的体系配置时，需要参照不同平台数字 PCR 仪说明书，并且需要保证表 1 中所列组分的终浓度不变。 6.3 数字 PCR 反应程序 6.3.1 按照表 2 的程序进行数字 PCR 扩增。 表 2 数字 PCR 反应程序 反应温度 反应时间 循环数 热启动a95 ℃ 5 min 1 热循环（扩增）b94 ℃ 15 s 49 60 ℃ 1 min a ： 根据不同数字 PCR 平台的要求，可以对反应程序中热启动步骤进行修改，但是不得修改热循环（扩增） 步骤。 b ： 根据不同数字 PCR 平台的要求，有可能要在热循环（扩增）步骤结束后进行后处理，本后处理步骤按照不同 数字 PCR 平台说明书进行。 6.3.2 其他要求见 SN/T 5334.1。 7 结果判定与表述 结果计算见 SN/T 5334.1。 —— 检测结果中内标准基因与外源基因均符合阴性以及空白的质量控制要求，说明未检出苜蓿 内源基因 ACC，表述为“未检出苜蓿成分” ； —— 检测结果中，内标准基因结果为阳性，但是外源基因符合阴性以及空白的质量控制要求， 说明检出苜蓿内源基因 ACC，但未检出 XXX 品系特异性序列，表述为“未检出苜蓿 XXX 转基因品系” ； —— 检测结果中，内标准基因与外源基因组均符合试样数字 PCR 检测的质量控制要求，说明该 转基因品系 XXX 检测为阳性且满足定量要求，表述为“检出苜蓿 XXX 转基因品系，含量为 XX%。以正式出版文本为准3 SN/T 5334.7—20208 防污染措施 防污染措施见 SN/T 5334.1 的规定。 9 样品保存 样品保存见 SN/T 5334.1 的规定。以正式出版文本为准4 SN/T 5334.7—2020附 录 A （资料性附录） 商业化的转基因苜蓿外源基因的主要信息 A.1 转基因苜蓿 J101 品系外源基因和苜蓿边界序列（来自 US20060272042） 1 ATTAAATCAA ATTTTCATAT TAAATTTTTA ATTTTATAGT AATAATCTAA TTTTAATACA 61 CTTAGGTGTA AAAAAAATTT AAGCTTCAAA GTTTTATATT GTCAGCAAAT CACAACTAAT 121 TGTGTGTACG GATACAAAGT CAAACATGAT TTATTGACGG TGTAAAAAAT CTTTACAGTG 181 ACAATGTATA TGGATTAAAT CGATTTTATA TTAGTTATTT TATGTTATAT CGTATTCATG 241 TCATGTGTTT TGTACTGATC TTGTGTCATA GTTTCAAACA CTGATAGTTT AAACTGAAGG 301 CGGGAAACGA CAATCTGATC CCCATCAAGC TTCTGCAGGT CCTGCTCGAG TGGAAGCTAA 361 TTCTCAGTCC AAAGCCTCAA CAAGGTCAGG GTACAGAGTC TCCAAACCAT TAGCCAAAAG 421 CTACAGGAGA TCAATGAAGA ATCTTCAATC AAAGTAAACT ACTGTTCCAG CACATGCATC A.2 转基因苜蓿 J163 品系外源基因和苜蓿边界序列（来自 US20060272042） 1 TTTCTTACTT CCTAGATTTG GTAGGGTTGA AACACATGAA AATTTAAAGC ATATACACAA 61 TACATTTTGG ACTTGACTTG ACTTCACTAT TCATAATGAG CTTCATGCAT ATTTGGATGC 121 CCATATCATA TCAAGTCATT ATTTTATTTT CCTTTTAACG ATTACCCCCT CCTACTTTTT 181 TCCTTCTTTG CCGGGACAAG GTCATCCAAA CTGAAGTGTT CGGTGGGAAA CGACACTCTG 241 ATCCCCATCA AGCTTCTGCA GGTCCTGCTC GAGTGGAAGC TAATTCTCAG TCCAAAGCCT 301 CAACAAGGTC AGGGTACAGA GTCTCCAAAC CATTAGCCAA AAGCTACAGG AGATCAATGA 361 AGAATCTTCA ATCAAAGTAA ACTACTGTTC CAGCACATGC ATCATGGTCA GTAAGTTTCA 421 GAAAAAGACA TCCACCGAAG ACTTAAAGTT AGTGGGCATC TTTG