以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5334.5 —2020 转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 5 部分：转基因棉花 Protocol of digital PCR for quantitatively detecting genetically modified plants and their derived products — Part 5: Genetically Modified Cotton 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5334.5—2020前 言 SN/T 5334— 2020《转基因植物产品的数字 PCR 检测方法》分为 8 个部分： ——第 1 部分：通用要求及定义；——第 2 部分：转基因大豆；——第 3 部分：转基因玉米；——第 4 部分：转基因油菜；——第 5 部分：转基因棉花；——第 6 部分：转基因马铃薯； ——第 7 部分：转基因苜蓿； ——第 8 部分：转基因甜菜。本文件为 SN/T 5334— 2020 的第 5 部分。本文件按照 GB/T1.1— 2020 给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海海关。本文件主要起草人：李想、黄新新、刘静远、蔡一村、蒋静、左翠花、郭德华、朱雅君、付伟、 何宇平、刘月明、朱鹏宇、黄文胜、朱水芳。 I以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5334.5—2020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 5 部分：转基因棉花 1 范围 本文件规定了 GHB119、T304 -40、GHB614、LLCotton25、MON1445、MON15985 -7、MON88913 等 7 个转基因棉花品系的转化事件特异性数字 PCR 检测方法。 本文件适用于棉籽、棉籽粕、棉花叶子中上述 7 个转基因棉花品系的检测。本文件的定量检测下 限为 40 pg（约 20 拷贝）棉花基因组 DNA 或 0.1%（ w/w）含量转基因棉花品系成分。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 SN/T 5334.1 转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 1 部分：通用要求及定义 3 术语和定义 SN/T 5334.1 界定的术语与定义适用于本文件。 4 方法原理 见 SN/T 5334.1 5 主要设备及试剂 5.1 内源基因和外源基因：内源基因为 Adhc 基因；外源序列为品系 GHB614、MON1445、MON88913 外源基因插入位点 5 ’端跨边界序列，品系 GHB119、T304 -40、LLCotton25、MON15985 -7 外源基因插入 位点 3 ’端跨边界序列。引物及探针序列参见附录 A。 5.2 其他设备及试剂要求见 SN/T 5334.1 的规定。 6 方法操作步骤 6.1 一般性操作步骤 一般性操作步骤按照 SN/T 5334.1 的规定执行。 6.2 数字 PCR 反应体系配制 按表 1 将各组分加入洁净离心管中，充分混匀。PCR 体系配制及转移时尽量避免产生气泡。每 个测试样和质控样品的 Adhc 基因及转化体特异性序列的数字 PCR 应设置至少 3 个平行重复。以正式出版文本为准2 SN/T 5334.5—2020表 1 数字 PCR 反应体系 试剂 终浓度 2× 数字 PCR 预混液 1× 上游引物（10 μmol/L） 0.9 μmol/L 下游引物（10 μmol/L） 0.9 μmol/L 荧光标记探针（10 μmol/L） 0.25 μmol/L DNA 模板 — dH2O（无菌水） — 注： 数字 PCR 反应体系的总体积可根据不同厂家、型号的数字 PCR 仪作相应调整。PCR 体系配制及转移时尽量避免 产生气泡。 6.3 数字 PCR 反应程序 根据仪器要求，将配制好的数字 PCR 反应混合液，加入微反应体系生成装置的加样孔中，按仪 器操作说明生成微反应体系。将微反应体系放置于 PCR 扩增仪中，按以下参数进行 PCR 扩增：95 ℃， 5 min（1 ℃/s）,1 个 循 环；94 ℃，15 s，59 ℃，1 min（1 ℃/s） ，40 个 循 环；98 ℃ 10 min（1 ℃/s） ， 1 个循环；12 ℃ 保存反应产物。对微反应体系进行荧光检测，记录阳性和阴性微反应体系数量及其 比值。根据比值分别计算数字 PCR 反应体系中的 Adhc 基因拷贝数（copies/ μL）和品系特异性序列拷 贝数（copies/ μL ）。 注：PCR 反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。 7 结果判定与表述 结果计算见 SN/T 5334.1。——检测结果中内标准基因与外源基因均符合阴性以及空白的质量控制要求，说明该样品未检出 棉花内标准 Adhc 基因，表述为“该样品未检出棉花成分” ； ——检测结果中，内标准基因结果为阳性，但是外源基因符合阴性以及空白的质量控制要求，说 明该样品检出棉花内标准 Adhc 基因，但未检出品系特异性序列，表述为“该样品未检出转基因棉花 XX 品系成分” ； ——检测结果中，内标准基因与外源基因均符合数字 PCR 检测的质量控制要求，说明该样品转 基因棉花 XXX 品系检测为阳性且满足定量要求，表述为“该样品检出转基因棉花 XXX 品系成分，含 量为 XX%” 。 8 防污染措施 防污染措施见 SN/T 5334.1 的规定。 9 样品保存 样品保存见 SN/T 5334.1 的规定。以正式出版文本为准3 SN/T 5334.5—2020附　录　A （资料性附录） 转基因棉花品系特异性序列 A.1 品系特异性序列 A.1.1 转基因棉花 GHB119 3 ’端品系特异性序列 CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCATGGACCTGCAGGTCGACGGCCGAGTACTGTTTTATTTTTAAC AGGAATTTGAGTCACGCAATTTC A.1.2 转基因棉花 T304 -40 3 ’端品系特异性序列 AGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATCTCCTTTTTCTTTTCAAGTTATCCC AAGATCTAGGA.1.3 转基因棉花 GHB614 5 ’端转化体特异性序列 CAAATACACTTGGAACGACTTCGTTTTA GGCTCCATGGCGATCGCTACGTTCTAGAATTCCTGCAGG TCGAGTCGCGACGTACGTTCGAACAATTGGTTTTAAAAGCTTGCATGCCTGCA.1.4 转基因棉花 LLCotton25 3 ’端转化体特异性序列 CAAGGAACTATTCAACTGAGCTTAACAGTACTCGGCCGTCGACCGCGGTACCCGGAATTCCAATCCC ACAAAAATCTG A.1.5 转基因棉花 MON1445 5 ’端转化体特异性序列 GGAGTAAGACGATTCAGATCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCC CAGCTTGGGCTGCAGGTCGAT A.1.6 转基因棉花 MON15985 -7 3 ’端转化体特异性序列 GTTACTAGATCGGGGATATCCCCGGGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCTGCACTGAAATCCCAT CCATTTAGCAACC TT A.1.7 转基因棉花 MON88913 5 ’端转化体特异性序列 CAAATTACCCATTAAGTAGCCAAATTACAAATTTTAATTCAATGTAGTCAAACACTGATAGTTTAAA CATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAAGCC 注：阴影部分为转基因棉花品系外源插入片段序列，带下划线部分为棉花基因组序列。 A.2 引物及探针序列 引物及探针序列见表 A.1。以正式出版文本为准4 SN/T 5334.5—2020表 A.1 引物和探针序列 扩增基因 名称 序列（5 ’-3’） PCR 扩增片段长度 /bp 棉花内参照基因 Adhc上游引物 CACATGACTTAGCCCATCTTTGC 73 下游引物 CCCACCCTTTTTTGGTTTAGC 探针 FAM -TGCAGGTTTTGGTGCCACTGTGAATG -BHQ1 GHB119 3 ’端转化 体特异性序列上游引物 CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCA 90 下游引物 GAAATTGCGTGACTCAAATTCC 探针 FAM -CCTGCAGGTCGACGGCCGAGTAC -BHQ1 T304 -40 3 ’端转化 体特异性序列上游引物 AGCGCGCAAACTAGGATAAATT 78 下游引物 CCTAGATCTTGGGATAACTTGAAAAGA 探针 FAM -CGGTGTC