以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5334.4 —2020 转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 4 部分：转基因油菜 Protocol of digital PCR for quantitatively detecting genetically modified plants and their derived products — Part 4: Genetically modified canola 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5334.4—2020前 言 SN/T 5334— 2020《转基因植物产品的数字 PCR 检测方法》分为 8 个部分： ——第 1 部分：通用要求及定义；——第 2 部分：转基因大豆；——第 3 部分：转基因玉米；——第 4 部分：转基因油菜；——第 5 部分：转基因棉花；——第 6 部分：转基因马铃薯； ——第 7 部分：转基因苜蓿； ——第 8 部分：转基因甜菜。本文件为 SN/T 5334— 2020 的第 4 部分。本文件按照 GB/T1.1— 2020 给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳海关食品检验检疫技术中心、 中华人民共和国上海海关、中华人民共和国拱北海关检验检疫技术中心。 本文件主要起草人：潘广、李想、姚丽锋，蔡教英，凌杏园，王小玉，游淑珠。 I 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准1 SN/T 5334.4—2020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 4 部分：转基因油菜 1 范围 本文件规定了油菜中转基因品系数字 PCR 定量检测方法。 本文件适用于油菜种子、叶片中 11 种转基因品系定量检测。本文件检测限参见附录 A。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 SN/T 5334.1 转基因产品定量检测数字 PCR 方法 第 1 部分：通用要求及定义 3 术语和定义 SN/T 5334.1 界定的术语与定义适用于本文件。 4 原理 见 SN/T 5334.1。 5 设备及试剂 5.1 内源基因和外源基因：内标准基因为油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEP） ；外源序列为品 系 73496、T45、MON88302 和 OXY235 外源基因插入位点 5 ’端跨边界序列，以及品系 Topas19/2、MS1、 MS8、Rf1、Rf2、Rf3 和 RT73 外源序列插入位点 3 ’端跨边界序列。引物及探针序列参见附录 A。 5.2 其他设备及试剂要求见 SN/T 5334.1 的规定。 6 方法操作步骤 6.1 一般性操作步骤 一般性操作步骤见 SN/T 5334.1 的规定。 6.2 数字 PCR 反应体系 6.2.1 双通道数字 PCR 反应体系 双通道数字 PCR 反应体系配制见表 1。 以正式出版文本为准2 SN/T 5334.4—2020表 1 双通道数字 PCR 反应体系 试剂 终浓度 2×dPCR Super Mix 1× 内参基因上游引物 参见附录 A 内参基因下游引物 参见附录 A 内参基因探针 参见附录 A 品系上游引物 参见附录 A 品系下游引物 参见附录 A 品系探针 参见附录 A DNA 模板 60 ng 水 补足至反应体系 注：推荐使用市面上现售的数字 PCR 平台进行实验。 6.2.2 单通道数字 PCR 反应体系 单通道数字 PCR 反应体系配制见表 2。 表 2 双通道数字 PCR 反应体系 试剂a终浓度 2×dPCR Super Mix 1× 上游引物 (10 μmol/L) 参见附录 A 下游引物 (10 μmol/L) 参见附录 A 探针 (10μmol/L) 参见附录 A DNA 模板 60 ng 水 补足至反应体系 a：推荐使用市面上现售的数字 PCR 平台进行实验。 6.3 数字 PCR 反应程序 数字 PCR 反应程序见表 3。 表 3 数字 PCR 反应程序 反应温度 反应时间 循环数 热启动a50 ℃ 2 min 1 95 ℃ 5 min 热变性 95 ℃ 15 s 40 退火b参见附录 A 60 s a：根据不同数字 PCR 平台的要求，可以对反应程序中热启动步骤进行修改，但是不得修改热循环（扩增）步骤。 b：根据不同数字 PCR 平台的要求，有可能要在热循环（扩增）步骤结束后进行后处理，可按照不同平台要求进行。 以正式出版文本为准3 SN/T 5334.4—2020７ 结果判定与表述 结果计算见 SN/T 5334.1。 结果表述如下：—— 检测结果中内标准基因与外源基因均符合阴性以及空白的质量控制要求，说明未检出油菜内 源基因 PEP，表述为“未检出油菜成分” ； —— 检测结果中，内标准基因结果为阳性，但是外源基因符合阴性以及空白的质量控制要求，说 明检出油菜内源基因 PEP，但未检出 ××× 品系特异性序列，表述为“未检出油菜 ××× 转基因品系” ； —— 检测结果中，内标准基因与外源基因组均符合试样数字 PCR 检测的质量控制要求，说明该 转基因品系 ××× 检测为阳性且满足定量要求，表述为“检出油菜 ××× 转基因品系，含量为 ××%。 8 防污染措施 防污染措施见 SN/T 5334.1 的规定。 9 样品保存 样品保存见 SN/T 5334.1 的规定。 以正式出版文本为准4 SN/T 5334.4—2020附 录 A （资料性附录） 引物探针序列、反应程序以及检测限 表 A.1 引物探针序列、反应程序以及检测限 基因 / 品系 名称序列 （5 ’-3’，品系探针除 73496 外， 均用 5 ’FAM、3 ’BHQ -1 标记）终浓度/ nM退火温度/ Tm）定性检 测限定量检 测限 PEP上游引物 CCCTTGTGAAGCTCGACATC 300 56 ℃ — — 下游引物 CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT 300 探针 HEX -CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA -BHQ -1 180 73496上游引物 GTTCTTCTCTTCATAGCTCATTACAGTTTT 300 56 ℃12 7 下游引物 CAAACCTCCATAGAGTTCAACATCTTAA 300 探针 TTAGTTAGATCAGGATATTCTTG1180 Rf1上游引物 GGTGACTACACGCGACTCAT 1 000 60 ℃ 3.7 18 下游引物 AGACCTCAATTGCGAGCTTTCTAAT 1 000 探针 CATCCTCACCCAGTCAGCATCATCAC 250 Rf2上游引物 ATCGACGTATATATAGCTGTGCCAG 1 000 60 ℃ 3.7 18 下游引物 CTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAA 1 000 探针 CTCACCGGCCAAATTCGCTCTTAGCCG 250 Topas 19/2上游引物 GTTGCGGTTCTGTCAGTTCC 300 56 ℃ 2 4 下游引物 CGACCGGCGCTGATATATGA 300 探针 TCCCGCGTCATCGGCGG 180 T45上游引物 TGCATATGGAATACAGTTGTAAATGAATT 300 56 ℃ 2 7 下游引物 TCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTT 300 探针 CCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTAGGTCCTC 180 MON88302上游引物 TCCTTGAACCTTATTTTATAGTGCACA 300 56 ℃ 2 6 下游引物 TCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCA 300 探针 TAGTCATCATGTTGTACCACTTCAAACACT 180 OXY235上游引物 ATTGACCATCATACTCATTGCTGA 300 56 ℃ 2 6 下游引物 AGAGAATCGTGAAATTATCTCTACCG 300 探针 CCATGTAGATTTCCCGGACATGAAGCC 180 MS82上游引物 CCTTGAGGACGCTTTGATCATATT 900 59 ℃ 2.3 11.5 下游引物 CCTTTTCTTATCGACCATGTACTC 900 探针 CCGAGTTCGACGGCCGAGTACTG 250 Rf32上游引物 GGAATTAACATCTACAAATTGCCTTT 900 59 ℃ 4.6 23 下游引物 TTGTAATTAGAAACCCTGAAATTTGT 900 探针 TCGCGAGATGAAAAAGGCATTTACC 250