以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5334.3—2020 转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 3 部分：转基因玉米 Protocol of digital PCR for quantitatively detecting genetically modified plants and their derived products — Part 3: Genetically modified maize 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本  880×1230  1/16   印张  0.5   字数  14  千字 2021 年 6 月第一版   2021 年 6 月第一次印刷 印数 1—000 书号：000·000   定价  14.00 元转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 3 部分：转基因玉米行   业   标   准 SN/T 5334.3—2020 * * *网址 www.customskb.com/book以正式出版文本为准 SN/T 5334.3—2020前 言 SN/T 5334—2020《转基因植物产品的数字 PCR 检测方法》共分为 8 个部分： ——第 1 部分：通用要求及定义； ——第 2 部分：转基因大豆；——第 3 部分：转基因玉米；——第 4 部分：转基因油菜；——第 5 部分：转基因棉花；——第 6 部分：转基因马铃薯； ——第 7 部分：转基因苜蓿； ——第 8 部分：转基因甜菜。本文件为 SN/T   5334—2020 的第 3 部分。 本文件按照 GB/T1.1—2020 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳海关食品检验检疫技术中心。本文件主要起草人：凌杏园、潘广、朱鹏宇、付伟、向才玉、章桂明、朱水芳、黄文胜。 I以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5334.3—2020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 3 部分：转基因玉米 1 范围 本文件规定了玉米中转基因品系数字 PCR 定量检测方法。 本文件适用于玉米种子、叶片中 10 种转基因品系定量检测。本文件检测限参见附录 A。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 SN/T   5334.1   转基因产品定量检测数字 PCR 方法    第 1 部分：通用要求及定义 3 术语和定义 SN/T   5334.1 界定的术语与定义适用于本文件。 4 方法原理 见 SN/T   5334.1。 5 主要设备及试剂 5.1   内源基因和外源基因：内源基因为玉米高速泳动蛋白基因（HMG ：high   mobility   group   proteins）； 外源基因为品系 98140、DAS40278 -9、VCO -01981 -5 和 MON87427 插入位点 5 ’端跨边界序列，以及 品系 BVLA430101、Bt799、IE034、12 -5、C0010.3.7 和 C0030.3.5 插入位点 3 ’端跨边界序列。引物及 探针序列参见附录 A。5.2   其他设备及试剂要求见 SN/T   5334.1 的规定。 6 方法操作步骤 6.1 一般性操作步骤 一般性操作步骤见 SN/T   5334.1 的规定。 6.2 数字 PCR 反应体系 实时荧光 PCR 反应体系配制见表 1。以正式出版文本为准2 SN/T 5334.3—2020表 1 数字 PCR 反应体系 试剂 终浓度 2×ddPCR   Super   Mix 1× 内参基因上游引物 参见附录 A 内参基因下游引物 参见附录 A 内参基因探针 参见附录 A 品系上游引物 参见附录 A 品系下游引物 参见附录 A 品系探针 参见附录 A DNA 模板 60   ng 水 补足至反应体系 注 ：推荐使用市面上现售的数字 PCR 平台进行实验 6.3 数字 PCR 反应程序 其他要求见 SN/T   5334.1，数字 PCR 反应程序见表 2。 表 2 数字 PCR 反应程序 反应温度 反应时间 循环数 热启动a50 ℃ 2   min 1 95   ℃ 5   min 热变性 95   ℃ 15   s 40 退火b参见附录 A 60   s a ： 根据不同数字PCR平台的要求，可以对反应程序中热启动步骤进行修改，但是不得修改热循环（扩增） 步骤。 b ： 根据不同数字PCR平台的要求，有可能要在热循环（扩增）步骤结束后进行后处理，可按照不同平台要 求进行。 7 结果判定与表述 结果计算见 SN/T   5334.1。 结果表述如下： ——   检测结果中内标准基因与外源基因均符合阴性以及空白的质量控制要求，说明未检出玉米 内源基因 Adh1，表述为“未检出玉米成分” ； ——   检测结果中，内标准基因结果为阳性，但是外源基因符合阴性以及空白的质量控制要求，说 明检出玉米内源基因Adh1，但未检出XXX品系特异性序列，表述为“未检出玉米XXX转 基因品系” ； ——   检测结果中，内标准基因与外源基因组均符合试样数字PCR检测的质量控制要求，说明该 转基因品系XXX检测为阳性且满足定量要求，表述为“检出玉米XXX转基因品系，含量为 XX%。以正式出版文本为准3 SN/T 5334.3—20208 防污染措施 防污染措施见 SN/T   5334.1 的规定。 9 样品保存 样品保存见 SN/T   5334.1 的规定。以正式出版文本为准 SN/T 5334.3—2020附 录 A （资料性附录） 引物探针序列、反应程序以及检测限 表 A.1 引物探针序列、反应程序以及检测限 基因 / 品系 名称序列 （5 ’-3’，品系探针均用 5 ’FAM、3 ’BHQ -1 标记）终浓度/ nM退火温度/ Tm定性检 测限定量检 测限 Adh1上游引物 TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA 300 60℃ — — 下游引物 GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT 300 探针 HEX -CAATCCACACAAACGCACGCGTA -BHQ -1180 98140上游引物 GTGTGTATGTCTCTTTGCTTGGTCTT 300 60℃12 12 下游引物 GATTGTCGTTTCCCGCCTTC 300 探针 CTCTATCGATCCCCCTCTTTGATAGTTTAAACT 180 DAS40278 -9上游引物 CACGAACCATTGAGTTACAATC 300 60℃12 5 下游引物 TGGTTCATTGTATTCTGGCTTTG 300 探针 CGTAGCTAACCTTCATTGTATTCCG 180 VCO -01981 -5上游引物 AAGGCCTTCAGTCTACTCCTCGGG 300 60℃12 5 下游引物 CTAGCGGCCGCTACTCGAGGGATTT 300 探针 CGTCACCAAGAAGATCAGTACTCAAACAC 180 MON87427上游引物 ACGGAAACGGTCGGGTCAAATG 300 60℃12 6 下游引物 CCATGTAGATTTCCCGGTTTTCTC 300 探针 TCGGGACAATATGGAGAAAAAGAAAGAG 180 BVLA430101上游引物 AATTGCGTTGCGCTCACT 500 60℃ 3 10 下游引物 GCAACACATGGGCACATACC 500 探针 CCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCC 250 Bt799上游引物 GTACCGTGGACTCCCTT 500 60℃ 3 10 下游引物 TAAGGTTTCGGTCCCAATTAC 500 探针 CCCGTCTCCTGTGAGATCAGCT 250 IE034上游引物 GAAGCAGGTCCCAGTATATTT 500 60℃ 3 10 下游引物 TTCGGCGTTAATTCAGTACA 500 探针 ACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGG 250 12-5上游引物 GAATGCTAGAGCAGCTTGA 500 60℃ 3 10 下游引物 CTCGAGCTCAACCACATC 500 探针 AGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGT 250 C0010.3.7上游引物 CGGTCCCGTTTAAACCTAAT 500 60℃ 3 10 下游引物 TGGATTCACCAGCCTCA 500 探针 TTCCAGGCAGCTACGCTCTCAC 250 C0030.3.5上游引物 CGGTCCCGTTTAAACCTAAT 500 60℃ 3 10 下游引物 TGGATTCACCAGCCTCA 500 探针 TTCC