以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5334.2 —2020 转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 2 部分：转基因大豆 Protocol of digital PCR for quantitatively detecting genetically modified plants and their derived products — Part 2: Genetically modified soybean 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5334.2—2020前 言 SN/T 5334— 2020《转基因植物产品的数字 PCR 检测方法》共分为 8 个部分： ——第 1 部分：通用要求及定义；——第 2 部分：转基因大豆；——第 3 部分：转基因玉米；——第 4 部分：转基因油菜；——第 5 部分：转基因棉花；——第 6 部分：转基因马铃薯； ——第 7 部分：转基因苜蓿； ——第 8 部分：转基因甜菜。本文件为 SN/T 5334— 2020 的第 2 部分。本文件按照 GB/T1.1— 2020 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国大连海关技术中心，中华人民共 和国沈阳海关技术中心，中华人民共和国广州海关技术中心、中华人民共和国青岛海关技术中心、中华人民共和国深圳海关食品检验检疫技术中心、中华人民共和国上海海关。 本文件主要起草人：曹际娟，郑秋月，肖西志，刘津，朱鹏宇，付伟，杨莉莉，徐君怡。 I以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5334.2—2020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 2 部分：转基因大豆 1 范围 本文件规定了进出口大豆中转基因品系特异性的数字 PCR（dPCR）定量检测方法。 本文件适用于大豆种子、叶片中转基因成分定量检测。本文件检测限参见附录 A。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 SN/T 5334.1 转基因产品定量检测数字 PCR 方法 第 1 部分：通用要求及定义 3 术语和定义 SN/T 5334.1 界定的术语与定义适用于本文件。 4 方法原理 见 SN/T 5334.1。 5 主要设备及试剂 5.1 内源基因和外源基因：内源基因为大豆植物凝集素基因（Lectin） ；外源序列为 FG72、MON87769、 MON87708、MON87705、DAS -44406 -6、DAS -81419 -2、356043、4305423、CV127、GTS 40 -3-2、A5547 - 127、MON89788、A2704 -12 品系外源基因插入位点 5 ’端跨边界序列，以及 DAS68416 -4 品系外源基因插 入位点 3 ’端跨边界序列。引物及探针序列参见附录 A。 5.2 其他设备及试剂要求见 SN/T 5334.1 的规定。 6 方法操作步骤 6.1 一般性操作步骤 一般性操作步骤见 SN/T 5334.1 的规定。 6.2 数字 PCR 反应体系 数字 PCR 反应体系配制见表 1。以正式出版文本为准2 SN/T 5334.2—2020表 1 数字 PCR 反应体系 试剂1终浓度 2×ddPCR Super Mix 1× 内参基因上游引物 参见附录 内参基因下游引物 参见附录 内参基因探针 参见附录 品系上游引物 参见附录 品系下游引物 参见附录 品系探针 参见附录 DNA 模板 60 ng 水 补足至反应体系 注 ： 推荐使用市面上现售的数字 PCR 平台进行实验，并针对市面上现售的不同数字 PCR 平台依据说明书调整 反应体系的组分和最终体积，并保证表中所列组分的终浓度不变。 6.3 数字 PCR 反应程序 数字 PCR 反应程序见表 2。 表 2 数字 PCR 反应程序 反应温度 /℃ 反应时间 循环数 热启动a95 5 min 1 热循环（扩增） b94 见表 3 见表 3 60 见附录 a ： 根据不同数字 PCR 平台的要求，可以对反应程序中热启动步骤进行修改，但是不得修改热循环（扩增） 步骤。 b ： 根据不同数字 PCR 平台的要求，有可能要在热循环（扩增）步骤结束后进行后处理，本后处理步骤按照不 同数字 PCR 平台说明书进行。 表 3 不同转基因品系对应的变性时间及循环数 基因 / 品系 变性时间 /s 循环数 Lectin 15 49 FG72 15 49 MON87769 15 49 MON87708 15 49 MON87705 15 49 DAS -44406 -6 15 49 DAS -81419 -2 15 49 356043 15 44 305423 15 44 CV127 30 44以正式出版文本为准3 SN/T 5334.2—2020基因 / 品系 变性时间 /s 循环数 GTS 40 -3-2 30 44 A5547 -127 15 49 MON89788 15 49 A2704 -12 15 49 DAS68416 -4 15 49 7 结果判定与表述 结果计算方法见 SN/T 5334.1。 结果表述如下：—— 检测结果中内标准基因与外源基因均符合阴性以及空白的质量控制要求，说明未检出大豆内 源基因 Lectin，表述为“未检出大豆成分” ； —— 检测结果中，内标准基因结果为阳性，但是外源基因符合阴性以及空白的质量控制要求，说 明检出大豆内源基因 Lectin，但未检出 XXX 品系特异性序列，表述为“未检出大豆 XXX 转 基因品系” ； —— 检测结果中，内标准基因与外源基因组均符合试样数字 PCR 检测的质量控制要求，说明该 转基因品系 XXX 检测为阳性且满足定量要求，表述为“检出大豆 XXX 转基因品系，含量为XX%。 8 防污染措施 防污染措施见 SN/T 5334.1 的规定。 9 样品保存 样品保存见 SN/T 5334.1 的规定。表 3 （续）以正式出版文本为准4 SN/T 5334.2—2020附 录 A （资料性附录） 引物探针序列、反应程序以及检测限 表 A.1 引物探针序列、反应程序以及检测限 基因 / 品系 名称 序列（5 ’-3’）终浓度 / （mol/L）退火时 间/s定性检测 限/μL定量检测 限/μL Lectin上游引物 CCTCCTCGGGAAAGTTACAA 400 60 — — 下游引物 GGGCATAGAAGGTGAAGTT 400 探针 FAM -CCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCT - BHQ1 200 FG72上游引物 AGATTTGATCGGGCTGCAGG 400 60 1.0 5.0 下游引物 GCACGTATTGATGACCGCATTA 400 探针 FAM -AATGTGGTTCATCCGTCTT -MGBNFQ 200 MON87769上游引物 CATACTCATTGCTGATCCATGTAGATT 400 60 1.5 7.0 下游引物 GCAAGTTGCTCGTGAAGTTTTG 400 探针 FAM -CCCGGACATGAAGCCATTTACAATTGA -TAMRA 200 MON87708上游引物 TCATACTCATTGCTGATCCATGTAG 200 60 1.0 8.0 下游引物 AGAACAAATTAACGAAAAGACAGAACG 200 探针 FAM -TCCCGGACTTTAGCTCAAAATGCATGTA -TAMRA 100 MON87705上游引物 TTCCCGGACATGAAGCCATTTAC 400 60 1.0 8.0 下游引物 GCAACGGTGCCTTGGCCCAAAG 400 探针 FAM -AAGAGACTCAGGGTGTTGTTATCACTGCGG -MGBNFQ 200 DAS -44406 -6上游引物 TTATTGTTCTTGTTGTTTCCTCTTTAGG 400 60 1.0 8.0 下游引物 CCTCAATTGCGAGCTTTCTAATTT 400 探针 FAM -ATTCGGACCTCCATGATGACCTTACCGTT -TAMRA 200 DAS -81419 -2上游引物 TCTAGCTATATTTAGCACTTGATATTCAT 400 60 1.25 5.0 下游引物 GCTTCAAGATCCCAACTTGCG 400 探针 FAM -ATCAACAGGCACCGATGCGCACCG -TAMR 200 356043上游引物 GTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAA 750 60 3.0 5.0 下游引物 TTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGT 750 探针 FAM - CTCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCAC -TAMRA 200 305423上游引物 CGTGTTCTCTTTTTGGCTA