以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5333 —2020 玉米霜霉病菌（非中国种） 检疫鉴定方法 RDetection and identification of Peronosclerospora spp. (non -Chinese) 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5333—2020I前 言 本文件按照 GB/T1.1— 2020 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、长沙海关技术中心、河口海关。 本文件起草人：吴品珊、罗志萍、雷荣、段禄华、陈岩。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5333—2020玉米霜霉病菌（非中国种） 检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了爪哇霜霉病菌、菲律宾霜霉病菌、甘蔗霜霉病菌和高粱霜霉病菌 4 种玉米霜霉病菌 非中国种的检疫鉴定方法。 本文件适用于玉米、高粱和甘蔗等禾本科植物的植株及种子中玉米霜霉病菌（非中国种）的检疫 和鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 病菌的基本信息 学名： Peronosclerospora spp. 分类地位：藻菌界 Chromista，卵菌门 Oomycota ，霜霉纲 Peronosporea ，霜霉目 Peronosporales， 霜霉科 Peronosporaceae ，霜指霉属 Peronosclerospora 。 玉米霜霉病菌（非中国种）指霜指霉属（ Peronosclerospora ）中的爪哇霜霉病菌（ P. maydis ）、 菲 律宾霜霉病菌（ P. philippinensis ） 、甘蔗霜霉病菌（ P. sacchari ）和高粱霜霉病菌（ P. sorghi ） ，它们专 性寄生于玉米、高粱和甘蔗等禾本科植物上，在热带和亚热带危害严重。 传播途径：病菌主要在野生寄主上越冬，翌年侵染玉米等寄主作物。病菌近距离传播主要靠染病 叶片上的分生孢子或卵孢子，远距离传播主要靠寄主植物插条、高粱种子、种子中夹带的病残体或新 鲜湿润的种子。 玉米霜霉病菌（非中国种）的其它信息参见附录 A。 5 方法原理 根据玉米霜霉病菌（非中国种）4 种病原菌的形态学特征和分子生物学特性，利用通用引物和特 异性引物进行 PCR 扩增并测序比对的原理，对病菌进行综合检疫鉴定。 6 仪器设备和主要试剂 6.1 仪器设备 生物显微镜（具测量功能） ，体视显微镜，超净工作台，天平，高压灭菌锅，台式高速离心机，以正式出版文本为准2 SN/T 5333—2020pH 计，低温冰箱、常规冰箱、水浴箱， PCR 扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。 6.2 主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 席尔氏浮载剂，乳酚油，氢氧化钠，苯胺蓝，PCR 缓冲液、 dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、 Taq DNA 聚合酶，dNTPs，通用引物 ITS5/ ITS4，特异性引物引 物 Pssm -2/Pssm -3 和特异性引物 Pmly -1/Pmly -2。 7 检疫鉴定方法 7.1 症状检查 4 种病菌在寄主植株上引致的症状近似。观察玉米、甘蔗和高粱叶片是否有褪绿色条斑，叶基部 是否变黄，叶背面是否有白色霉层（参见附录 A） 。 检查挑取瘦小、霉变、畸形的种子，以及种子中夹带的病残体、高粱颖壳，观察是否有病斑， 病斑是否有霉层。 7.2 形态学鉴定 对于有霉层的病斑，直接挑取病菌分生孢子囊和孢囊梗制片镜检，或用小块透明胶带粘取霉层 制片镜检。观测记录分生孢子囊和孢囊梗的形状、大小，分生孢子囊至少测量 30 个。 7.3 组织透明检测 取病残体、种皮、种子的颖壳，在 10% 氢氧化钠中煮沸透明 10~20min，苯胺蓝染色、镜检，观 察菌丝形态和卵孢子。 7.4 分子生物学鉴定 7.4.1 DNA 提取 对于有霉层的病组织，直接搜集病菌提取 DNA ；对于无霉层的病组织，取病变部位用液氮研磨， 然后提取 DNA。 按 CTAB 方法提取 DNA 参见附录 B。 7.4.2 PCR 反应及序列比对 对于病菌D N A ，利用真菌通用引物I T S 5 （ 5 ’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG -3’） 和 ITS4 （5’-TCCTCCGCT - TATTGATATGC -3’）进行扩增，然后测序。 对于病组织的 DNA，用特异性引物引物 Pssm -2/Pssm -3 （Pssm -2 ：5 ’-GTGAAGGCTAGCGGCTT -3’， Pssm -3 ：5 ’-AGAGACTTTCGTCCCCACAG -3’） 或 Pmly -1/Pmly -2（Pmly -1 ：5 ’ - GGATGTCTGCGATCATCGATTTGAA -3’ ，Pmly -2 ：5 ’-ATCCAGGAGACTTTTCCAACTTAAT -3’）进行扩 增，然后测序。 PCR 反应程序参见附录 C。 将获得的序列与 N C B I 网站 G e n b a n k 中公开发表的 Peronosclerospora maydis 、Peronosclerospora philippinensis 、Peronosclerospora sacchari 和Peronosclerospora sorghi 的序列进行相似性比对分析。以正式出版文本为准3 SN/T 5333—20208 鉴定特征 8.1 症状特征 玉米受侵染后全株呈淡绿色，逐渐变为黄色或浅黄色，直至枯死。成株受害，多自中部叶片的基 部开始发病，叶基部褪绿或产生退绿条斑，逐渐向上蔓延，形成淡黄至白色条斑、黄绿相间的条纹， 严重时叶片全部失绿。潮湿情况下，叶背面可见病菌霉层。 甘蔗病株矮化、茎细小，叶窄直立，叶条纹颜色绿黄或黄，逐渐变为红褐色或深红色。 高粱病株叶片窄、较为直立，叶基部黄化，直至整个叶片出现黄白色长条纹，潮湿时在叶片黄 化部位的上下表现均可出现白色霉层。 8.2 形态学特征 Peronosclerospora maydis ：菌丝体无色多核，菌丝有不同形状的吸器。孢囊梗自气孔伸出，无色， 基部细，有一隔膜，上部肥大，双分叉 2~4 次，整体呈圆锥形，梗长 150~550 μm，小梗近圆锥形弯 曲，顶生一个分生孢子囊。分生孢子囊无色，长椭圆形至近球形，大小为 16~26 μm×15~20 μm，萌发 生芽管。未发现卵孢子。 Peronosclerospora philippinensis ：菌丝体无色多核，不规则收缩与膨大，吸器简单，泡囊状至近指 状，2×8 μm。 孢囊梗自气孔伸出，无色，长 150~400 μm，双分枝 2~4 次，分枝粗壮，小梗锥形，稍弯， 长 10μm。分生孢子囊无色，长卵形至圆柱形，顶端稍圆，大小为 27~39 μm×17~21 μm，萌发生芽管。 卵孢子罕见，球形，壁光滑，直径 15.3~22.6 μm。 Peronosclerospora sacchari ：菌丝体无色多核。孢子囊单个或成双从气孔伸出，无色直立，长 160~170μm， 基 部 略 细， 宽 10~15 μm ，有足细胞 ，向上渐粗约为基部的 2 ~ 3 倍 ， 0 ~ 2 隔膜 ，上 部双分枝 2 ~ 3 次 。分生孢子囊无色，椭圆、长椭圆或长卵形，顶端圆，基部稍尖或圆，大小 为 25~41 μm×15~23 μm，萌发生芽管。卵孢子黄色，球形或稍呈多角形，直径 40~50 μm，壁厚 3.8~5μm。 Peronosclerospora sorghi ：菌丝体无色多核。孢囊梗直立，无色，长为 180~300 μm，有足细胞，顶 端二叉分枝 1~3 次，分枝粗短常排列成半球形，小梗尖，顶生一个分生孢子囊。分生孢子囊近圆形， 大小为 15~26.9 μm×15~28.9 μm，萌发生芽管。卵孢子无色球形，大小为 25~42.9 μm，平均 36 μm，具 有淡黄色外壁。 病菌形态图和 4 个近似种的形态比较参见附录 A。 8.3 序列对和 PCR 特异性产物 通用引物 PCR 扩增片段大小约为 442bp，测序结果与 NCBI 网站 Genbank 中 Peronosclerospora maydis 、Peronosclerospora philippinensis 、Peronosclerospora sacchari 和Peronosclerospora sorghi 的序列比对， 相似性应为 98% 以上。 特 异 性 引 物 Pssm-2/ Pssm-3 扩 增 出 的 目 标 片 段 大 小 为 120bp 左 右； 引 物 Pmly-1/Pmly-2 扩 增 的 目 标 片 段 大 小 为 200bp 左 右。 测 序 结 果 与 NCBI 网 站 Genbank 中 Peronosclerospora maydis 、 Peronosclerospora philippinensis 、Peronosclerospora sacchari 和Peronosclerospora sorghi 的序列比对，相似 性应为 98% 以上。 9 结果判定 寄主植株的症状和病菌形态与 8.1 和