以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5325.5 —2020 出口食品中食源性病毒定量检测 数字 PCR 法 第 5 部分 ：星状病毒 Digital PCR method for quantitative detection of foodborne viruses in export foods Part 5: Human Astrovirus 2020 -12-30 发布 2021 -07-01 实施ICS 67.050 CCS X 04 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5325.5—2020I前 言 SN/T 5235— 2020《出口食品中食源性病毒定量检测 数字 PCR 法》共分为 7 个部分： 第 1 部分：诺如病毒； 第 2 部分：甲型肝炎病毒； 第 3 部分：轮状病毒； 第 4 部分：札如病毒； 第 5 部分：星状病毒； 第 6 部分：柯萨奇病毒； 第 7 部分：脊髓灰质炎病毒。 本部分为 SN/T 5235— 2020 的第 5 部分。 本部分根据 GB/T 1.1— 2009 给出的规则编写。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国北京海关、中华人民共和国上海海关。 本部分主要起草人： 徐蕾蕊、马丹、李丹、魏咏新、曾静、魏海燕、印丽萍、黄新新、何宇平、 蒋原。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5325.5—2020出口食品中食源性病毒定量检测 数字 PCR 法 第 5 部分：星状病毒 1 范围 本部分规定了贝类、硬质表面食品、生食蔬菜、软质水果等食品中星状病毒的数字 PCR 检测 方法。 本部分适用于贝类、硬质表面食品、生食蔬菜、软质水果等食品中星状病毒的定量检测。 本方法所能达到的检测限为 1 800 拷贝 / 2 g （贝类消化腺） ；1 800 拷贝 / 100 cm2（硬质表面食品） ； 3 600 拷贝 / 25 g（生食蔬菜和软质水果） 。 本方法所能达到的定量限为 3 600 拷贝 / 2 g （贝类消化腺） ；3 600 拷贝 / 100 cm2（硬质表面食品） ； 7 200 拷贝 / 25 g（生食蔬菜和软质水果） 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析试验用水规格和试验方法。 3 术语、定义和缩略语 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 检测限 limit of determination （LOD ） 方法所能检测样品中最低的星状病毒基因含量。 3.2 定量限 limit of quantification （LOQ ） 在相对标准偏差不超过 25% 的条件下，方法所能定量检测的样品中最低星状病毒基因含量。 3.3 微反应体系 tiny reaction system 将含有模板、引物 / 探针、 Taq酶及其缓冲液充分混匀后分配至体积相同且相互物理隔离的油包 水液滴或其它微孔、微室中所形成的小体积荧光 PCR 反应体系。 3.4 过程质控物质 process control以正式出版文本为准2 SN/T 5325.5—2020通过添加与目的病毒类似的外源质控物质如 MS2 噬菌体，来监测整个检测过程，通过对最终过 程质控物质回收率的计算来评估检测过程的有效性和计算样品中病毒的实际含量。 3.5 外部控制 RNA external control RNA (EC RNA) 外源阳性对照 RNA，作为数字 PCR 过程的阳性对照。 3.6 有证标准物质 certified reference material 附有权威机构出具的证书，说明使用程序，获得具有相关不确定度和溯源性的一个或多个特性 值的标准物质。 3.7 缩略语 3.7.1 HAstV（Human Astrovirus） ：星状病毒。 3.7.2 PC（process control） ：过程质控。 3.7.3 EC RNA（external control RNA） ：外源控制 RNA。 3.7.4 pfu（plaque forming unit） ：噬斑形成单位。 4 原理 数字 PCR（digital PCR）是在荧光 PCR 基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模 板的绝对拷贝数测定。通过将含有模板、引物 / 探针、 Taq酶及其缓冲液的荧光 PCR 反应体系充分混 匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于 10 000 个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配至 微反应体系中。所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行 PCR 扩增反应后，根据设定的荧光阈 值判断每个微反应体系的扩增结果。依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字 PCR 反 应体系中的模板浓度。 5 设备及材料 5.1 数字 PCR 系统：包括微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或 其他具有同样功能仪器的系统。 5.2 核酸定量仪：Nanodrop3 000 或 Modulus 检测仪或其他核酸定量检测仪。 5.3 冷冻离心机。 5.4 生物安全柜。 5.5 低温冰箱：-80 ℃冰箱，-20 ℃冰箱。 5.6 天平：感量为 0.1 g。 5.7 均质器。 5.8 涡旋振荡仪。 5.9 高压灭菌锅。 5.10 恒温孵育器 / 箱：控温精度 ±1.0 ℃。 5.11 微量移液器：100 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、10 μL～100 μL、0.5 μL～10 μL、0.1 μL～2.5 μL。 5.12 数字 PCR 微反应体系生成联排管及覆膜或芯片。 5.13 网状过滤袋：400 mL。 5.14 无菌棉拭子。以正式出版文本为准3 SN/T 5325.5—20205.15 无菌剪刀。 5.16 无菌钳子。 5.17 无菌培养皿。 5.18 无 RNase 和 DNase 污染的玻璃容器。 5.19 无 RNase 离心管、无 RNase 移液器吸嘴、无 RNase 药匙、无 RNase PCR 薄壁管。 6 试剂 所有实验用试剂均为分析纯，符合 GB/T 6682 的要求；除特别说明外，实验用水为无 RNase 超 纯水。 6.1 一步法数字 RT -PCR 反应预混液。 6.2 果胶酶：来源于黑曲霉（ Aspergillus niger ）或棘孢曲霉（ Aspergillus aculeatus ）。 6.3 PC 物质，制备及定量方法见附录 A。 6.4 EC RNA ：制备及定量方法见附录 B。 6.5 Tris/ 甘氨酸 / 牛肉浸膏（TGBE）缓冲液：见 C.2.2。 6.6 5×PEG/NaCl 溶液：见 C.2.3。 6.7 磷酸盐缓冲液（PBS） ：见 C.2.4。 6.8 氯仿 / 正丁醇混合液：见 C.2.5。 6.9 蛋白酶 K 溶液：见 C.2.6。 6.10 75% 乙醇：见 C.2.7。 6.11 Trizol 试剂：见 C.2.8。 6.12 引物和探针：根据表 1 的序列合成引物和探针，加入无 RNase 超纯水配制成 10 μmol/L 浓度。 扩增序列参见附录 D。 表 1 数字 PCR 检测的引物和探针 病毒 名称引物和探针序列（方向 5’ -3 ’）扩增片段 大小（bp）参考毒株基因序列 号及扩增基因位置 HAstVORF2F（正向引物） ： AAG CAG GTA ACT GTT GAG GTC ORF2R（反向引物） ： GGT TTT GGT CCT GTG ACA C ORF2P（探针） ： FAM -TCA ACG TGT CCG TAA CAT TGT CAA TAA -BHQ1218GenBank 登录号： JF 327666.1， （4 385-4 602） MS2 噬菌体MS2-TM3 -F（正向引物） ： GGC TGC TCG CGG ATA CCC MS2-TM3 -R（反向引物） ： TGA GGG AAT GTG GGA ACC G MS2-TM3 -P（探针） ： VIC -ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT -BHQ1202GenBank 登录号： JF 719743.1， （3 135-3 336） 注： 荧光标记： FAM、VIC 代表荧光报告基团，BHQ1 代表荧光猝灭基团，反应过程中应选择相应的荧光通 道。 7 检测程序 星状病毒数字 PCR 定量检测程序见图 1。以正式出版文本为准4 SN/T 5325.5—2020病毒富集前处理 根据过程质控物质的回收率计算样 品中甲型肝炎病毒的实际含 量RNA提取和纯化硬质表面食品 ≤100cm2软质水果和生食蔬菜 25g 贝类消化腺 2.0g 过程质控物 质 数字 PCR检测添加 确保实验有效空白对照阴性； 阴性对照阴性；阳性对照阳性； 计算过程质控物质回收 率，要求回收率≥ 1%静置吸附 30min 图 1 星状病毒数字 PCR 定量检测程序 8 操作步骤 8.1 质控物质的选取 8.1.1 PC 物质 选择 MS2 噬菌体或其他等效物质作为 HAstV 检测的 PC 物质。体外